Thèse--Méd.--Reims, 1973. N°: N° 21. / Bibliogr. ff. I-X.

Thèse--Méd.--Reims, 1973. N°: N° 48. / Bibliogr. ff. I-V.

Les méthodes pour le diagnostic des infections à mycobactéries sont restées pratiquement inchangées pendant des décennies et n'auraient probablement pas progressé sans la réémergence inattendue de la tuberculose (TB) au cours des vingt dernières années du 20ème siècle. Le diagnostic de laboratoire de la tuberculose pulmonaire repose principalement sur la détection des organismes du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC) dans les prélèvements respiratoires par leur isolement et identification ou par les méthodes moléculaires. Pour les patients qui n’expectorent pas, des échantillons du tractus respiratoire peuvent être obtenus par des procédures invasives. En nous basant sur la survie connue de MTC dans le liquide gastrique, nous avons considéré que les MTC devraient également être détectables dans les selles. Nous avons recherché des MTC en parallèle dans des échantillons de tractus respiratoire et dans les selles récoltés des mêmes patients. Mycobacterium tuberculosis a été détecté après décontamination à la chlorhexidine dans des cultures sur des milieux à base d'œuf et par l'examen direct microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen. Après la mise au point d’une technique originale d’extraction de l’ADN total à partir des selles, nous avons utilisé la détection de M. tuberculosis par PCR en temps réel en duplex utilisant le gène IS6110 comme cible moléculaire et un contrôle interne de présence d’inhibiteurs de la PCR. Ces travaux mettent en évidence l’intérêt et la sensibilité de l’analyse des selles pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Cette technique est aujourd’hui utilisée dans notre laboratoire en routine et est en cours d’évaluation par d’autres équipes.Actuellement, l'identification des mycobactéries basée sur l’analyse des caractéristiques biochimiques (test à l’uréase, test de la nitrate réductase, test de la résistance à la pyrazinamide (pza), test de la sensibilité, test de la résistance à la thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) etc …) est le plus souvent remplacée par des méthodes de biologie moléculaire dont l’amplification par PCR d'un gène spécifique. Ces méthodes sont laborieuses et peuvent exiger un degré d'expertise élevé. Afin de simplifier l'identification précise des isolats de mycobactéries en laboratoire de routine, après avoir vérifié l’inactivation des MTC par la chaleur et l’éthanol pour pouvoir travailler hors du laboratoire P3, nous avons mis au point les conditions pour l'utilisation de la spectrométrie de masse « matrix-assisted laser desorption and ionisation-time-of-flight» (MALDI-TOF-MS) en association avec un logiciel bioinformatique spécifique, comme outil d’identification et de différenciation entre les membres du complexe MTC, du complexe Mycobacterium avium et les autres mycobactéries non-tuberculeuses. Nous avons ensuite appliqué cette technique afin d’identifier les mycobactéries à partir du milieu liquide Middlebrook 7H10 utilisé dans une étuve automatisée. L’identification des mycobactéries isolées dans notre laboratoire, est maintenant réalisée en routine par MALDI-TOF-MS. L’ensemble de ces travaux contribue à améliorer le diagnostic de routine de la tuberculose pulmonaire et les techniques mises au point sont utilisées en routine dans notre laboratoire, en particulier dans le cadre d’un « kit tuberculose ». / The diagnosis of mycobacterial infections remained practically unchanged during numerous decades and would not probably have progressed of the whole without the unexpected re-emergence of the tuberculosis (TB) during the last twenty years of the 20th century.The diagnosis of laboratory of pulmonary tuberculosis is mainly based on the detection of microorganisms of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) in the respiratory specimens. For the patients who do not expectorate, samples of the respiratory tract can be only obtained according to invasive procedures. Based on the survival known for MTC organisms in the gastric liquid, we considered that MTC organisms would be detectable also in samples of stools. We compared the presence of bodies MTC in samples of respiratory tract and the specimens of stools collected from the same patients. MTC was detected in cultures on egg-based media after appropriate decontamination using the chlorhexidine and by the microscopic examination after Ziehl-Neelsen staining. After the set on of an original protocol of the total DNA extraction from stools, we were able to use by the detection with the real-time PCR of IS6110 using internal controls as PCR inhibitor control. This protocol illustrate the utility of stool analysis for the diagnosis of pulmonary tuberculosis, this technique is actually used in routine in our laboratory, it is also under investigation by other research teams.Phenotypic identification of mycobacteria based on the analysis of biochemical pattern (urase test, nitrate reductase test, resistance to pyrazinamide (pza) test, susceptibility to thiophen-2-carboxylic acid hydrazide (TCH) test, etc …) is more often replaced by molecular methods using DNA, including the development by PCR of a specific gene. These methods are generally laborious and can require a considerable degree of expertise. To simplify the identification specifies isolates of mycobacteria routinely in the laboratory, we estimated the use of the mass spectrometry "matrix-assisted laser desorption and ionization-time-of-flight" (MALDI-TOF MS) in association with a specific bioIT software, was capable of identifying and of distinguishing between the members of Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium avium complex and the non- tuberculosis mycobacteria. We verified the MTC inactivation by heating or by ethanol allowing the analysis of the inactivated MTC out of the P3 laboratory; we studied the cost-effectiveness of this method from the blood solid media by extrapolating this approach in the emergent countries. We then applied the same method to identify mycobacteria from Middlebrook 7H10 liquid media used in an automated oven. Identification of cultured Mycobacteria is now done in routine in our laboratory by MALDI-TOF-MS. These data contribute in improving the routine diagnosis of pulmonary tuberculosis and this protocol is then used routinely in our laboratory, particularly with the “kit de tuberculose” we set on.

L'isolement de Mycobacterium tuberculosis par culture est la méthode de référence pour le diagnostic de la tuberculose. Le but de notre travail était d'améliorer et de faciliter le diagnostic par culture de la tuberculose. Dans un premier temps, nous avons produit une revue bibliographique en comparant les différentes techniques ou protocoles utilisés pour le diagnostic de la tuberculose. Ce travail nous a permis d'actualiser notre protocole de diagnostic, avec la mise en place d’un "kit-tuberculose" contenant des containers imprégnés de chlorhexidine pour la récupération et la décontamination directe d’échantillons cliniques non- invasifs, suivi par la culture sur un milieu solide à base d'oeuf, et détection des colonies par microscope inversé ou par un système d'imagerie en temps réel. Nous avons mis en place une méthode de décontamination par 0,7%-chlorhexidine et avons montré que cette méthode était plus efficace que la méthode de référence NALC-NaOH. Ensuite, nous avons développé un milieu de culture à base de sérum animal, le MOD9 dont nous avons montré par une étude comparative qu'il était supérieur au milieu solide LJ de référence. Une deuxième étude comparant un protocole de décontamination par la chlorhexidine et culture sur milieu MOD9 au protocole standard, NALC-NaOH/Bactec960 a montré une supériorité par rapport au protocole standard. Enfin, la mise en place d'un système de détection des micro-colonies de M. tuberculosis sur MOD9 par imagerie en temps réel Advencis-Biosystem a permis de réduire le temps de détection de M. tuberculosis à 3,2 jours avec le protocole chlorhexidine/MOD9/Advencis, avec un record mondial de détection en 25h. / Isolation of Mycobacterium tuberculosis by culture is the gold standard for the diagnosis of tuberculosis. The aim of my thesis work was to simplify and improve the culture diagnosis of tuberculosis. At first we started with a bibliographic study, comparing step by step the different techniques and protocols that have been used for the diagnosis of tuberculosis. This work has allowed us to update our tuberculosis diagnosis protocol, starting with the implementation of a "Tuberculosis-kit" consisting of chlorhexidine containing containers for the recovery and decontamination of non-invasive specimens, followed by culture on an egg-based medium, a micro- colonies detection using an inverted microscope or an automated real-time imaging incubator system and finally an identification using mass spectrometry. We established a new chlorhexidine- based decontamination method that we showed to be more efficient for the recovery and isolation of M. tuberculosis than the standard NALC-NaOH method. Than we developed a new serum-based culture medium, the MOD9 that we showed in a comparative study to be superior to the reference LJ medium for the recovery of M. tuberculosis. In a second study we proved that our chlorhexidine/MOD9 protocol was superior to the standard NALC-NaOH/Bactec 960 MGIT protocol for the isolation of M. tuberculosis. And finally the implementation of a real time imaging system for the detection of M. tuberculosis micro-colonies on MOD9 permits us to dramatically reduce the detection time from 15 days with the standard NALC-NaOH/Bactec 960 MGIT protocol to 3.2 days with our 0.7%-chlorhexidine/MOD9/Advencis-Biosystem protocol with a world record detection time of 25h.