RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.

RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.