Abstract Resistin was discovered in the year 2000. In the mouse, it was reported to be produced by adipocytes and to be linked with insulin resistance and obesity. Human resistin has been shown to be produced by leucocytes but the literature contains contradictory results on its association with obesity and type 2 diabetes. Aim of this study was to clarify the role of resistin in the human context especially in type 2 diabetes and atherosclerosis. The first study examined the possible association of human resistin gene variants with type 2 diabetes. The studied three variants were not associated with type 2 diabetes though they were demonstrated in the second study to be associated with the plasma resistin concentration. However, two gene variants were associated with the prevalence of cerebrovascular disease in subjects with type 2 diabetes. In the third work, the association of the plasma resistin level with the risk factors of atherosclerosis and early atherosclerosis measured with carotid artery intima-media thickness (IMT) were studied. Plasma resistin level was not associated with IMT independently from the known risk factors of atherosclerosis. However, resistin was associated with inflammatory markers highly sensitive CRP and the number of leucocytes whereas insulin resistance did not associate with resistin. In the fourth study, resistin expression in different leucocytes and its modulation, as well as the effect of resistin on monocyte adhesion to endothelium were evaluated. The novel discovery was that resistin is expressed in all the main leucocyte lineages, with monocytes and neutrophils exhibiting the highest relative mRNA and protein levels of resistin. Resistin expression was up-regulated by pro-inflammatory factors in the cells of both innate and adaptive immunity. The present results demonstrating that resistin increases adhesion and expression of some adhesion molecules support the hypothesis that resistin may be involved in the development of atherosclerosis. The above results indicate that resistin is widely produced by leucocytes and therefore may participate in inflammatory processes. Since it may be considered as an inflammatory cytokine, resistin may also influence the development of atherosclerosis. In the future, resistin could possibly be used as a marker of inflammation. / Tiivistelmä Vereen erittyvä uusi hormoni, resistiini, löydettiin vuonna 2000. Hiirellä resistiinin on havaittu erittyvän rasvasoluista ja sen on arveltu toimivan linkkinä lihavuuden ja insuliiniresistenssin välillä. Ihmisellä resistiinin tehtävä on toistaiseksi huomattavasti epäselvempi ja toisin kuin hiirellä ihmisen resistiinin korkein ilmentymistaso on valkosoluissa. Tämän väitöstutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ihmisen resistiinin toimintaa ja erityisesti sen liittymäkohtia tyypin 2 diabetekseen ja ateroskleroosiin. Ensimmäisessä osatyössä on selvitetty resistiini-geenin nukleotidimuuntelun yhteyttä tyypin 2 diabetekseen ja siihen liittyviin tekijöihin diabetespotilasaineistossa. Resistiinin geenimuuntelu ei tulosten perusteella ole yhteydessä tyypin 2 diabetekseen, vaikka sillä näyttääkin olevan vaikutusta plasman resistiini-pitoisuuteen, mikä havaittiin toisessa osatyössä. Geenimuuntelulla oli havaittavissa yhteyttä aivovaltimosairauteen. Kolmannessa osatyössä plasman resistiinipitoisuuden yhteyttä valtimonkovettumatautiin ja sen riskitekijöihin tutkittiin Pohjois-Pohjanmaalta kerätyssä aineistossa (n = 525). Plasman resistiinipitoisuudella ei havaittu itsenäistä yhteyttä kaulavaltimonseinämänpaksuuteen, joka kuvastaa alkuvaiheen valtimokovettumataudin tasoa. Tulehdukselliset merkit kuten veren valkosolujen määrä ja plasman CRP-pitoisuus liittyivät suurentuneeseen plasman resistiinipitoisuuteen mutta insuliiniresistenssimuuttujat eivät. Neljännessä osatyössä tutkittiin resistiinin ilmentymistä. Resistiinin havaittiin ilmentyvän kaikissa keskeisissä valkosolutyypeissä ja lisäksi tulehdustekijät lisäsivät sen tuottoa. Erityisesti neutrofiileissä ja monosyyteissä resistiinin ilmentymistasot olivat korkeita. Endoteelisoluilla selvitettiin resistiinin vaikutuksia ateroskleroosiin liittyviin muutoksiin. Resistiini lisäsi monosyyttien kiinnittymistä endoteelisoluihin, mikä on tyypillinen ilmiö varhaiselle ateroskleroosille. Tämän työn tulosten perusteella ihmisen resistiinillä ei ole merkittävää yhteyttä insuliiniresistenssiin ja tyypin 2 diabetekseen. Sen sijaan havainto resistiinin ilmentymisestä useammissa valkosolutyypeissä, kuin mitä aikaisemmin on raportoitu, ja yhteys tulehdustekijöihin osoittaa, että ihmisen resistiinin toiminta liittyy tulehdustiloihin. Resistiini aiheuttaa myös endoteelisoluissa samanlaisia ateroskleroosille altistavia muutoksia kuin muutkin tulehdustekijät. Tulevaisuudessa plasman resistiini-pitoisuutta voidaan mahdollisesti käyttää tulehdustilojen arvioinnissa.

Abstract Sepsis is a common problem in the intensive care unit (ICU) still having a high mortality and causing high costs to health care system. Currently, there is no marker to distinguish sepsis from other causes of systemic inflammation. Leukocyte surface molecules have been proposed as markers of sepsis. The most promising markers have been neutrophil CD64 and CD11b on monocytes and neutrophils and HLA-DR on monocytes. In this thesis, leukocyte surface molecules were investigated using quantitative flow cytometry in critically ill patients with sepsis, non-septic ICU controls, and healthy volunteers. The surface molecules of interest were neutrophil CD11b and CD64, monocyte CD11b, CD14, CD40, CD64, CD80, HLA-DR, and lymphocyte CD69. First, a special emphasize was indicated in methodological aspects of the quantitative flow cytometry. Then, the surface molecule kinetics was investigated in different types of critically ill patients. Finally, the diagnostic performance of the molecules was determined and compared to that of traditionally used sepsis markers. Furthermore, an example of multiple marker analysis was introduced as a diagnostic tool. The optimal circumstances for leukocyte surface molecule analysis were +4°C temperature throughout the collection and preparation of the samples using tubes containing acid citrate dextrose (ACD) as an anticoagulant, followed by flow cytometry within 6 hours from sampling. Monocyte CD11b and CD40, neutrophil CD11b and CD64, and CD69 on CD4+ T cells and natural killer (NK) cells separated sepsis from non-septic ICU controls and healthy volunteers, neutrophil CD64, having the best area under curve. Procalcitonin (PCT) was second best marker. Monocyte CD40 and NK CD69 may predict positive blood culture detection, whereas CD11b may predict early mortality. In multiple marker analysis, combination of positive neutrophil CD64, C-reactive protein (CRP) and PCT increased post-test probability for sepsis. In conclusion, pre-analytical and analytical factors have effects on results of leukocyte surface molecule analysis. Leukocyte surface molecules may improve sepsis diagnostics in ICU setting. Neutrophil CD64 was the most promising marker. Combination of CD64, CRP and PCT increased the detection of sepsis in ICU. / Tiivistelmä Sepsis on yleinen tehohoidon ongelma, johon liittyy korkea kuolleisuus ja suuret hoidolliset kustannukset. Toistaiseksi ei ole laboratoriomerkkiainetta, joka erottaisi sepsistä sairastavat muista kriittisesti sairaista, joilla on yleistynyt tulehdusvaste. Valkosolujen pintamolekyylien käyttöä sepsiksen laboratoriomerkkiaineena on tutkittu. Lupaavimmat näistä molekyyleistä ovat olleet neutrofiilien CD64, monosyyttien ja neutrofiilien CD11b ja monosyyttien HLA-DR. Tässä väitöskirjassa tutkittiin valkosolujen pintamolekyylejä kriittisesti sairailla sepsistä sairastavilla potilailla, niillä tehohoitopotilailla, joilla ei ollut sepsistä, ja terveillä vapaaehtoisilla virtaussytometriaa käyttäen. Mielenkiinnon kohteina olivat neutrofiilien CD11b ja CD64, monosyyttien CD11b, CD14, CD40, CD64, CD80 ja HLA-DR, sekä lymfosyyttien CD69. Ensimmäiseksi tutkittiin kvantitatiivista virtaussytometriaa menetelmänä. Sen jälkeen pintamolekyylien kinetiikkaa tutkittiin eri potilasryhmillä. Lopuksi määritettiin pintamolekyylien diagnostinen tehokkuus ja sitä verrattiin perinteisempiin sepsiksen diagnostiikassa käytettyihin laboratoriomerkkiaineisiin. Lisäksi selvitettiin usean merkkiaineen mallin diagnostista osuvuutta. Parhaat olosuhteet virtaussytometrialle olivat: +4 °C:n lämpötila näytteenoton ja -käsittelyn aikana, näytteiden ottaminen putkiin, joissa on antikoagulanttina hapan sitraatti-dekstroosi (ACD) ja näytteiden analysointi kuuden tunnin kuluessa näytteenotosta. Monosyyttien CD11b ja CD40, neutrofiilien CD11b ja CD64 sekä CD4+ T-solujen ja NK-solujen CD69 erottivat sepsistä sairastavat tehohoitoverrokeista ja terveistä. Neutrofiilien CD64:llä oli paras erottelukyky. Prokalsitoniini (PCT) oli toiseksi paras merkkiaine. Monosyyttien CD40 ja NK-solujen CD69 voivat parantaa positiivisen veriviljelylöydöksen havaitsemista, kun taas CD11b voi ennustaa varhaista potilaan menehtymistä. Usean merkkiaineen mallissa neutrofiilien CD64 paransi C-reaktiivisen proteiinin (CRP) ja PCT:n tehoa sepsiksen diagnostiikassa. Loppupäätelmänä on, että valkosolujen pintamolekyylien analysointivaiheen eri muuttujilla on vaikutusta virtaussytometriatuloksiin. Valkosolujen pintamolekyylien käyttö voi parantaa sepsiksen diagnostiikkaa teho-osastolla. Neutrofiilien CD64 oli lupaavin merkkiaine. Neutrofiilien CD64:n, CRP:n ja PCT:n yhdistelmä paransi sepsiksen diagnostiikkaa teho-osastolla.