Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.

Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.