Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno / A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venom

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice.

El ofidismo como problemática de salud en el Perú, requiere ser atendido con estudios dirigidos a optimizar la acción de los antivenenos producidos comercialmente y además, desarrollar nuevas tecnologías destinadas a este propósito. En este aspecto, la producción de inmunoglobulina Y específica (IgY) de origen aviar es una alternativa frente a los antivenenos equinos, y es el tema en la presente investigación. Se inmunizaron gallinas ponedoras de la raza Light Brown Leghorn con 500 µg del veneno de Bothrops atrox, emulsificado con adyuvante de Freund, siguiendo la aparición de anticuerpos en suero con la técnica de inmuno difusión doble. Los anticuerpos aviares fueron aislados de la yema de huevos que contenían los niveles más altos de IgY específica, determinados previamente por la técnica de ELISA, utilizando precipitación negativa con ácido caprílico y un paso adicional de precipitación positiva con sulfato de amonio. La masa de anticuerpos recuperados fue de 8,5 ± 1,35 mg/mL de yema habiéndose determinado en 8,3% la cantidad de IgY específica mediante cromatografía de afinidad en una columna de Sepharosa 4B-veneno. El antiveneno aviar tuvo una DE50 de 575 µL de antiveneno/mg de veneno y una potencia de 1,74 mg de veneno/mL de antiveneno aviar. Asimismo, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de Bothrops brazili comparte más epítopes comunes con el veneno de Bothrops atrox ya que se obtuvo un valor de 46% de reactividad cruzada en tanto que los venenos de Bothrops pictus y Bothrops barnetti tuvieron valores de 41% y 37% respectivamente; se encontró además que los venenos de Crotalus durissus (12%) y Lachesis muta (19%) tuvieron una baja reactividad cruzada con el veneno en estudio. / Ofidism as a health problem in Perú requires to be attended either optimizing commercial antivenom potency and developing news technologist on this. Production of specific avian immunoglobulin Y is an alternative in relationship IgG horse antibodies, which is the main point of this research. Laying Light Brow Leghorn chickens were immunizated with 500 µg of Bothrops atrox snake venom emulsificated with Complete Freund’s adjuvant, and the IgY antibodies production was evaluated with the double immunodiffusion method. The avian antibodies were isolated from egg yolk which contained high level of specific IgY, calculated by ELISA method. Using caprylic acid negative precipitation and ammonium sulfate positive precipitation, mass antibodies recovery was 8,5 ± 1,35 mg/ml of yolk and after step on sepharosa 4B-venom affinity chromatographic, specific IgY recovery was 8,3% . The avian antivenom had a ED50: 575 µL antivenom/mg of venom and potency was 1,74 mg of venom/ml of avian antivenom. In addition, the crossing reactivity assays showed that Bothrops brazili venom share more common epitope with Bothrops atrox venom with a value of 46% of crossing reactivity whilest the Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms had values of 41% and 37% respectly; in contrast the venoms of Crotalus durissus (12%) and Lachesis muta (19%) had low crossing reactivity with Bothrops atrox venom.