Abstract Glaucoma is a group of eye diseases characterized by a chronic, progressive optic neuropathy. During the disease process, the axon damage of the retinal ganglion cells leads to changes in the retinal nerve fiber layer, causing optic nerve head, and visual field defects typical of glaucoma. The Heidelberg Retina Tomograph (HRT) is a confocal scanning laser imaging device acquiring and analysing three-dimensional data of the ocular fundus wit good accuracy and reproducibility. Conventional planimetric measurements were compared to those taken with the HRT in a pilot study of 12 eyes with early glaucomatous optic disc, retinal nerve fiber layer and/or visual field abnormalities. The neuroretinal rim area measurements and cup-to-disc area ratio did not differ statistically from each other when using these two different methods. The effect of four different reference levels on the HRT parameter measurement values was tested in two separate studies. In the first study there were 67 eyes, 40 of the eyes were healthy and 27 eyes had glaucoma of different stages. Then, 279 eyes, 180 of which were non-glaucomatous and 99 glaucoma eyes, were included in another study. The flexible reference level gave the most reliable HRT parameter measurement values in both non-glaucomatous and glaucomatous eyes. The ability of the HRT parameters to separate between non-glaucomatous and glaucomatous eyes was tested in 77 eyes, 40 of the eyes were non-glaucomatous, 10 ocular hypertensives and 27 eyes had different stages of glaucoma. The reference level dependent HRT parameters cup-to-disc area ratio, vertical linear cup-to-disc ratio, mean retinal nerve fiber layer thickness (RNFLt) and rim volume as well as the reference level non-dependent HRT parameter, cup shape measure (CSM), separated best between the clinical groups. The best combination of the HRT and other structural and functional parameters in separating between non-glaucomatous and glaucomatous eyes was studied in 55 eyes. There were 32 non-glaucomatous eyes and 23 eyes with ocular hypertension or glaucoma. CSM, RNFLt, together with age- and lens coloration-corrected mean deviation of the B/Y perimetry showed good discrimination (ROC area 0.91) between non-glaucomatous and glaucomatous eyes. / Tiivistelmä Glaukooma koostuu joukosta hitaasti eteneviä näköhermon rappeumasairauksia. Sairausprosessin aikana verkkokalvon gangliosolujen aksonivaurio johtaa muutoksiin verkkokalvon hermosäiekerroksessa ja näköhermon päässä aiheuttaen glaukoomalle tyypillisiä näkökenttämuutoksia. The Heidelberg Retina Tomograph (HRT) on konfokaali laserskanneritekniikkaan perustuva kuvantamislaite, joka tuottaa ja analysoi silmänpohjasta saatua kolmiulotteista mittaustietoa tarkasti ja toistettavasti. Tavanomaisen planimetrian antamia mittaustuloksia verrattiin HRT:n antamiin tuloksiin 12:ssa silmässä, joissa oli todettu varhaisia glaukoomamuutoksia. Näköhermon pään hermoreunan (rim) pinta-ala ja keskuskuopan suhde papillan läpimittaan eivät poikenneet tilastollisesti toisistaan näitä kahta menetelmää käytettäessä. Neljän eri referenssitason vaikutusta HRT-parametrien mittausarvoihin testattiin kahdessa eri tutkimuksessa. Ensimmäisen tutkimusaineisto koostui yhteensä 67:stä silmästä, joista 40 oli terveitä ja 27:ssä eriasteisia glaukoomamuutoksia. Toisessa tutkimuksessa oli yhteensä 279 silmää, joista 180 oli terveitä ja 99:llä oli glaukooma. Papillomakulaarisäikeisiin tukeutuva, fleksiibeli referenssitaso antoi luotettavimmat HRT-parametrien mittaustulokset sekä terveissä että glaukoomasilmissä. HRT-parametrien kykyä erottaa terveet silmät glaukomatoottisista testattiin yhteensä 77:ssä silmässä, joista 40 oli terveitä, 10 oli korkeapaineisia ilman glaukoomamuutoksia, ja 27:ssä oli glaukoomamuutoksia. Referenssitasosta riippuvaiset HRT-parametrit, keskuskuopan suhde papillan läpimittaan, vertikaali-lineaarinen keskuskuopan suhde papillan läpimittaan, keskimääräinen verkkokalvon hermosäiekerroksen paksuus (RNFLt) ja `rim´:in tilavuus samoin kuin referenssitasosta riippumaton keskuskuopan ´vinous´-mitta (CSM) erottelivat parhaiten nämä kliiniset ryhmät toisistaan. Terveitä ja glaukoomasilmiä erottelevaa HRT:n ja muiden rakenteellisten ja toiminnallisten parametrien kombinaatiota etsittiin 55:n silmän aineistosta. Silmistä 32 oli terveitä ja 23 korkeapaineisia ja/tai glaukoomavaurioisia. CSM ja RNFLt, yhdessä iän ja mykiövärjäytymisen suhteen korjatun sinikeltaperimetrian keskipoikkeaman kanssa osoittivat hyvää erottelukykyä (ROC area 0.91) terveiden ja glaukoomasilmien välillä.

Abstract Collagen XVIII is an evolutionarily conserved, ubiquitously-expressed basement membrane (BM) proteoglycan produced in three isoforms, the individual roles of which are largely unknown. The physiological in vivo roles of these collagen XVIII isoforms are studied here using novel genetically modified mouse strains deficient in either the short or the medium/long isoforms of the molecule. In addition, the effects of keratin-14-driven overexpression of the thrombospondin-1 (Tsp-1) –like domain, which is common to all three collagen XVIII isoforms, are studied. The findings underline the importance of the short collagen XVIII isoform in the eye, as its absence was sufficient to cause the aberrant vascularisation of the retina previously reported in mice lacking all isoforms of collagen XVIII. In addition, an excess of the collagen XVIII Tsp-1 domain led to serious eye abnormalities, possibly by interfering with the functions of the full-length collagen XVIII produced in mice. Collagen XVIII was also shown to contribute to adipogenesis in an isoform-specific manner, in that a lack of the medium/long isoforms of collagen XVIII led to impaired adipocyte maturation and the subsequent reduction in the adipocyte number induced liver steatosis and hypertriglyceridaemia. Hence this work establishes a new extracellular matrix ECM-directed mechanism contributing to control over the multistep adipogenesis programme and points to the functional consequences of its impairment for ectopic fat deposition. The enzymatic remodelling of ECM components results in molecules with novel biological activities. Arresten is a collagen IV(α1)-derived fragment with anti-angiogenic properties which was originally described as not having any direct anti-tumour effects on cancer cells themselves. The present data revealed novel inhibitory roles for arresten in oral squamous carcinoma cell proliferation, survival, motility and invasion. Since arresten is a potent inhibitor of angiogenesis, the data generated here further underline the possibility for using it as a therapeutic agent in cases of cancer. / Tiivistelmä Kollageeni XVIII on tyvikalvojen proteoglykaani ja yksi harvoista evoluutiossa konservoituneista kollageeneista. Se esiintyy elimistössä kolmena isomuotona, joiden biologiset tehtävät ovat vielä jokseenkin epäselviä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin kollageeni XVIII:n isomuotojen fysiologista merkitystä hyödyntäen uusia hiirilinjoja, joilta kollageeni XVIII:n lyhyt tai kaksi pisintä varianttia oli geneettisesti inaktivoitu. Poistogeenisten hiirimallien rinnalle tehtiin kaikille varianteille yhteistä trombospondiini-1 (Tsp-1)-domeinia yli-ilmentävä hiirilinja. Tämän väitöskirjatutkimuksen avulla saatiin uutta tietoa kollageeni XVIII:n ja etenkin sen lyhimmän variantin tärkeästä roolista silmässä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet kollageeni XVIII:n puutteen häiritsevän silmän verkkokalvon verisuonituksen normaalia kehittymistä. Tässä työssä havaittiin, että pelkästään lyhyen isomuodon puute riitti altistamaan hiiret muutoksille verkkokalvon suonituksessa. Tsp-1-osan ylimäärän havaittiin lisäksi alistavan hiiret muutoksille silmän rakenteessa, mahdollisesti häiritsemällä silmässä jo olemassa olevan kollageeni XVIII:n toimintaa. Tässä työssä havaittiin myös uusi yhteys kollageeni XVIII:n ja rasvasolujen kypsymisen välillä. Verrokkihiiriin verrattuna muodostuvan rasvakudoksen havaittiin jäävän merkittävästi vähäisemmäksi poistogeenisillä hiirillä, joilta kollageeni XVIII:n pitkät isomuodot olivat geneettisesti inaktivoitu. Heikentynyt rasvakudoksen muodostuminen lisäsi triglyseridien kertymistä hiiren verenkiertoon ja maksaan. Tutkimustulos on merkittävä avaus soluväliaineen merkityksestä rasva-aineenvaihdunnalle ja kannustaa lisätutkimuksilla selvittämään, onko kollageeni XVIII:lla yhteys myös ihmisen metaboliseen oireyhtymään. Soluväliaineen komponenttien entsymaattinen muokkaus tuottaa usein molekyylejä, joilla on uusia isäntämolekyyleistä poikkeavia ominaisuuksia. Tässä työssä tutkittiin yhden tällaisen molekyylin, tyvikalvokollageenin IV hajoamistuotteen, arrestenin, suoria vaikutuksia syöpäsoluille. Arrestenin tiedettiin entuudestaan estävän syöpäkasvainten verisuonten uudismuodostusta koe-eläimillä. Työssä osoitettiin, että arresten vaikutti endoteelisolujen lisäksi myös itse syöpäsoluihin estäen niiden lisääntymistä ja vähentäen niiden elinkykyä ja liikkuvuutta, mikä tekee arrestenista entistä houkuttelevamman ehdokasmolekyylin lääkekehitystyöhön.

Abstract Transgenic mice were used to evaluate the roles of collagens XV and XVIII in retinal vessel development and to examine the roles of collagen XV and laminin α4 in peripheral nerve development and function. Also, in vitro methods were used to study the functions of recombinant, full-length human collagen XV produced in insect cells. The lack of collagen XVIII alone was found to result in overproliferation of astrocytes in the mouse retina and deficient vascularization of the retina, which was ultimately rescued by the persistent hyaloid vessels. VEGF mRNA expression was appropriately regulated in the retina of the collagen XVIII deficient mice, which also showed reduced susceptibility to oxygen-induced neovascularization. Lack of collagen XV alone had no obvious effect on the mouse eye, but an abnormal migration of astrocytes onto the persistent hyaloid vessels could be seen in mice lacking both collagens XVIII and XV. Recombinant full-length human collagen XV was seen in rotary shadowing EM as an extended protein with numerous kinks and a globular domain at its N-terminus. The mean length of the molecules was 241 nm and they had a tendency to form aggregates. Collagen XV attaches to the collagen binding region of fibronectin and to a lesser extent to vitronectin and laminin. It was rapidly bound to cultured cells with a staining pattern co-localizing with fibronectin. Collagen XV was also found to inhibit the adhesion and migration of cells in vitro. Lack of collagen XV in mice was found to result in ultrastructural abnormalities in the sciatic nerves, such as polyaxonal myelination and more loosely packed C-fibres, mild impairment of BM assembly and mild motor dysfunction with a lower sensory nerve conduction velocity. Polyaxonal myelination and a failure in the segregation of axons were evident in laminin α4 null mice, which also had diminished amounts of C-fibres, BM abnormalities, diminished myelin and a greater myelin period compared with wild-type mice. They performed poorly in the round beam test and showed diminished compound muscle action potentials. A simultaneous lack of collagen XV and laminin α4 resulted in a permanent defect in the segregation of axons and C-fibre development. The performance of the double null mice on the round beam was poor relative to the other genotypes. / Tiivistelmä Tässä väitöskirjatyössä on tutkittu kollageenien XV ja XVIII merkitystä silmän verkkokalvon verisuonituksen kehittymiselle sekä kollageeni XV:n ja laminiini α4:n merkitystä ääreishermon kehittymiselle ja toiminnalle käyttäen hyväksi muuntogeenisiä hiiriä. Lisäksi tässä työssä on käytetty in vitro –menetelmiä hyönteissoluissa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetun kollageeni XV:n toiminnan tutkimiseksi. Kollageeni XVIII:n puutteen todettiin johtavan verkkokalvon astrosyyttien määrän lisääntymiseen sekä verkkokalvon suonituksen kehittymiseen epänormaalilla tavalla lasiaissuonista, jotka eivät olleetkaan hävinneet kehityksen aikana. VEGF:n lähetti-RNA:n ilmentyminen oli asianmukaisesti säädelty eri verkkokalvon alueilla kollageeni XVIII:n suhteen poistogeenisillä hiirillä, joilla kehittyi myös vähemmän uudissuonia matalalle hapen osapaineelle altistamisen jälkeen. Kollageeni XV:n puute ei johtanut havaittaviin muutoksiin silmässä, mutta molempien kollageenien XV ja XVIII puuttuessa havaittiin silmässä epänormaalia astrosyyttien soluvaellusta lasiaissuonten päälle. Tässä väitöskirjatyössä osoitetaan, että yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotettu kokopitkä ihmisen kollageeni XV näytti elektronimikroskopiassa pitkältä molekyyliltä, jonka pituus oli keskimäärin 241 nm ja joka sitoutui helposti toisiin kollageeni XV -molekyyleihin. Kollageeni XV sitoutuu fibronektiinin kollageenia sitovaan osaan sekä vitronektiiniin ja laminiiniin. Viljeltyihin soluihin kollageeni XV sitoutui siten, että vasta-ainevärjäyksellä todettiin sen paikallistuvan samoille alueille fibronektiinin kanssa. Kollageeni XV:n todettiin myös vähentävän solujen kiinnittymistä ja liikkumista. Hiirissä kollageeni XV:n puutoksen todettiin johtavan iskiahermoissa polyaksonaaliseen myelinisaatioon, C-säikeiden lievään kehityshäiriöön, tyvikalvon koostumuksen häiriöön, lieviin motorisiin vaikeuksiin ja matalampaan tuntohermojen johtonopeuteen. Laminiini α4 –puutteisilla hiirillä oli todettavissa myös polyaksonaalista myelinisaatiota ja lisäksi häiriö aksonien erottelussa. Niiden hermoista löytyi myös tyvikalvon epämuodostumia, vähemmän myeliiniä ja C-säikeitä sekä suuremmat myeliinijaksot verrattuna villityypin hiiriin. Ne selviytyivät huonosti kävelytestissä ja niiden lihasten aktiopotentiaalit olivat pienemmät kuin kontrollihiirillä. Samanaikainen kollageeni XV:n ja laminiini α4:n puutos johti pysyvään aksonien erottelun ja C-säikeiden kehittymisen häiriöön. Kävelytestissä tuplapoistogeeniset hiiret selviytyivät huonoiten muihin genotyyppeihin verrattuna.