Universiẗat, Diss., 2006--Würzburg.

The impurity profiling of pharmaceutical ingredients can oppose many challenges. The best part of active pharmaceutical ingredients (APIs) and the related substances are detectable by UV detection, a very common detection principle. However, if an API lacks a suitable chromophore other means of detection are necessary. The corona charged aerosol detector (CAD) is a detector capable of detecting substances independent of their chemical structure. This “universal” detector has only one limitation: The analyte has to have a sufficiently low vapor pressure. Another important challenge that comes often together with the lack of a chromophore concerns the separation. These substances (e.g. most amino acids and derivatives) often contain structures that make them difficult to retain on conventional reversed phase columns. Possible solutions to overcome these challenges, like the application of the CAD and the benefit of so-called mixed-mode stationary phases in impurity profiling for pharmacopoeial purposes were explored in this work. The related substances analyzed in this thesis comprise amino acids, inorganic ions, bisphosphonic acids, basic and acidic derivatives of amino acids (esters and amides). The successful development and validation of mixed-mode liquid chromatography methods with CAD detection for carbocisteine and ibandronate sodium might help to increase the acceptance of this versatile detector in the pharmaceutical industry and in official authorities dealing with the determination of related substances. The combination of UV and CAD detection proved very useful during the analysis of Bicisate. Most of the related substances and some unidentified impurities were detectable by CAD whereas a synthesis by-product, a semi-volatile ester, was only detectable in the UV trace. The simple combination covers all relevant impurities in a single analysis. Two truly orthogonal methods regarding separation and detection for the enantiomeric purity of magnesium-L-aspartate helped to find the reason for elevated D aspartic acid content in the drug substance. A very quick and sensitive indirect separation using the OPA derivatization with NAC was developed as a powerful screening tool, whereas the direct separation of D- and L-CBQCA-Asp derivatives confirmed the results. Both methods were optimized in order to do without substances mentioned on the REACH list, like sodium tetraborate which is very frequently applied in standard derivatization protocols and CE separations. The importance of orthogonal detection principles in the determination of related substances of amino acids was discussed in a review article dealing with the revision of amino acid monographs in the Ph. Eur.. / Die Reinheitsprüfung pharmazeutischer Wirkstoffe kann den Analytiker vor verschiedene Hürden stellen. So gilt für den größten Teil pharmazeutischer Wirkstoffe und deren verwandte Substanzen, dass sie mit Hilfe des weit verbreiteten UV-Detektors nachweisbar sind. Verfügt ein Wirkstoff hingegen nicht über ein geeignetes Chromophor, so benötigt man andere Möglichkeiten der Detektion. Der corona charged aerosol detector (CAD) ist in der Lage Substanzen unabhängig von ihrer chemischen Struktur zu detektieren, vorausgesetzt, sie sind schwerflüchtig. Eine weitere Herausforderung, die häufig mit dem Fehlen eines Chromophors einhergeht betrifft die Trennung. Verbindungen dieser Art (z.B. die meisten Aminosäuren und deren Derivate) enthalten häufig Strukturen, die eine Trennung auf konventionellen Umkehrphasen erschweren. Mögliche Ansätze um die genannten Herausforderungen zu meistern, wie zum Beispiel die Verwendung des CAD und sogenannter mixed-mode Phasen in der pharmazeutischen Reinheitsanalytik wurden erarbeitet und an konkreten Anwendungen erprobt. Die in dieser Arbeit bestimmten verwandten Substanzen sind vor allem Aminosäuren, anorganische Ionen, Bisphosphonate sowie basische und saure Derivate von Aminosäuren (Ester und Amide). Die erfolgreiche Entwicklung und Validierung von mixed-mode flüssig-chromatographischer Methoden kombiniert mit CAD für Carbocistein und Ibandronat Natrium könnte dabei helfen die Akzeptanz in der Pharmazeutischen Industrie und bei den für Reinheitsprüfungen zuständigen Behörden für diesen vielseitigen Detektor zu verbessern. Die Kombination von UV-Detektion und CAD erwies sich bei der Analyse von Bicisate als sehr nützlich. Die meisten verwandten Substanzen und einige unbekannte Verunreinigungen konnten mittels CAD detektiert werden, während ein Nebenprodukt der Synthese, ein halb-flüchtiger Ester, nur mit Hilfe des UV Detektors sichtbar war. Die Kombination zweier Detektionstechniken ermöglichte die Bestimmung aller relevanten Verunreinigungen in einer einzigen Analyse. Die Bestimmung der optischen Reinheit von Magnesium-L-Aspartat gelang mittels zweier orthogonaler Methoden und der Grund für das Auftreten von erhöhten Konzentrationen an D-Aspartat wurde gefunden. Eine schnelle indirekte Bestimmung der OPA/NAC-Derivate eignete sich als Screening-tool, während die direkte Trennung der enantiomeren CBQCA-Derivate die Ergebnisse bestätigte. Beide Methoden wurden im Hinblick darauf optimiert, dass sie ohne Substanzen wie Natriumtetraborat, eine Substanz auf der REACH Liste für besonders besorgniserregende Substanzen, sowie gebräuchlicher Puffer bei Derivatisierungsreaktionen und CZE Trennungen, auskamen. Die Bedeutung von orthogonalen Detektionstechniken bei der Bestimmung der verwandten Substanzen von Aminosäuren wurde in einem Übersichtsartikel, der in Zusammenhang mit der Revision von Aminosäuren Monographien des Europäischen Arzneibuches steht, diskutiert.

Halle, Wittenberg, University, Thesis (doctoral), 2001.

Techn. Universiẗat, Diss., 2000--Berlin.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden analytische Methoden zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils von Erythromycin entwickelt, die der bestehenden Ph.Eur.-Methode überlegen sind. Die neue HPLC-Methode ist in der Lage, alle verwandten Verbindungen mit angemessener Präzision nachzuweisen und zu quantifizieren. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten alle Hauptkomponenten und verwandten Verbindungen der Base, ihrer Ester und Salze eindeutig identifiziert und quantifiziert werden. Zudem konnten zwei neue verwandte Verbindungen von Erythromycin gefunden und als N,N-Didemethylerythromycin A und Anhydroerythromycin F identifiziert werden. / Within this work analytical methods for determination of the impurity profile of erythromycin were developed. These methods show clear improvements compared to the current methods described in the Ph.Eur. The new HPLC method is able to separate and quantify all related substances with an acceptable precision. The mass spectrometry shows the suitability for the direct qualitative and quantitative analysis of the base, ester and salts of erythromycin. Moreover using ion trap two new, unexpected EA related substances could be detected and identified as N,N-didemethylerythromycin A and anhydroerythromycin F.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchungen von Verunreinigungsprofilen von Aminosäuren aus biotechnologischer Herstellung. Dazu sollten die Aminosäuren Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser und Trp von verschiedenen Herstellern und aus unterschiedlichen Batches genauer unter die Lupe genommen werden. Mit der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen dünnschichtchromatographischen Methode (DC-Methode) für „mit Ninhydrin nachweisbare Substanzen“ können ausschließlich Fremdaminosäuren nachgewiesen werden und dies nur, wenn der jeweilige Gehalt relativ hoch ist. Andere Stoffgruppen, die aus der biotechnologischen Herstellung stammen, werden aufgrund der Trennbedingungen sowie der Detektionsart der DC-Methode nicht erfasst. Deshalb mussten neue Methoden entwickelt werden. Laut Vorschriften der International Conference of Harmonisation (ICH) müssen unbekannte Verunreinigungen in Wirkstoffen für orale Therapeutika auf 0,1 % w/w begrenzt werden können. In die Untersuchungen wurden neben den Fremdaminosäuren auch Peptide, Aminozucker und Nucleinsäuren als potentielle Verunreinigungen, die aus der Herstellung bzw. aus dem Reinigungsprozess kommen, einbezogen. Diese zusätzlichen Stoffgruppen können aus den „Nebenaktivitäten“ der Mikroorganismen entstehen. Aminosäuren, Peptide und Aminozucker wurden versucht, kapillarelektrophoretisch zu quantifizieren. Für die Bestimmung von Nucleinsäuren wurde zusätzlich die UV-Spektroskopie eingesetzt. / Aim of the present work was to investigate the impurity profiles of amino acids of biotechnological origin. Eight amino acids were included: Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser and Trp. The amino acid samples originating from different producers and different batches had to be studied in deeper detail. The thin-layer chromatographic method (TLC-method) of “ninhydrin-positive substances”, as described in the European Pharmacopoeia, is able to detect primarily other amino acids, if their respective content is relatively high. Other groups of substances of biotechnological origin cannot be detected due to the separation conditions and the detection principle of the TLC-method. Therefore new methods had to be developed. In accordance with the guidelines of the International Conference of Harmonisation (ICH), the content of unknown impurities in active ingredients for oral therapeutics should be limited to 0,1 % w/w. Apart from other amino acids, the study included peptides, amino sugars and nucleic acids as potential impurities, originating from production or purification processes. These additional groups of substances are byproducts of the biosynthesis pathways of microorganisms. An attempt was made to quantify the amino acids, peptides and amino sugars by means of capillary electrophoresis. UV-spectrophotometry was additionally used for the determination of nucleic acids.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006.

Würzburg, Universiẗat, Diss., 2008.

Universiẗat, Diss., 2000--Göttingen.

Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte. / The separation mechanism of capillary electrophoresis (CE) is based on the mobility of ions in an electric field. CE is a versatile technique, which can be operated in different modes. In this work, both aqueous capillary zone electrophoresis (CZE) and nonaqueous CE (NACE) and microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) were investigated. Using these CE methods, impurity analysis was accomplished for serveral pharmaceuticals, which are described in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): ethambutol, quetiapine, ephedrine, levodopa and correspondingly related substances. The active agent ethambutol is used in the (S,S)-configuration and in Ph. Eur. 7 the monograph describes the dichloride of the substance. In order to develop a separation method for (S,S)-ethambutol, its enantiomer and the achiral meso-compound were synthesized by the reaction of 2-amino-1-butanol and diethyloxalate. For the separation of these ethambutol compounds the CZE technique was chosen. After using an acid phosphate buffer, the concentration of the sample solution had to be set at 1 mg/ml for an sufficient UV adsorption (λ: 200 nm). After using a basic tetraborate buffer, the chromophore was more sensitive due to the electron pair of the nitrogen molecule, which led to higher peak intensity. Native α-, β- and γ-cyclodextins (CDs) and some derivatives of β-CD were added to the background electrolyte (BGE) as chiral selectors. The CZE method was modified in many ways, e. g. in molarity and pH value of the BGE, in concentration of the chiral selectors, in voltage and in temperature. In spite of various variations, the separation of the stereoisomers was not successful. A CD-modified MEEKC method was applied to separate the racemates of dopa, methyldopa, tyrosine and phenylalanine. For this purpose, a microemulsion (ME) was employed, which consisted of ethyl acetate, SDS, 1-butanol, phosphate buffer, sulf. β-CD and 2-propanol, used as an organic modifier, if necessary. For each DL-amino acid the composition of the ME and the instrument settings (voltage, temperature) were optimized. The separation of DL-dopa was accomplished without an organic modifier. Based on the methods evolved individually, two CD-modified MEEKC methods were developed to separate all four racemates. The concluding validation of these methods with respect of repeatability (resolution, migration time, ratio of the corrected peak areas, and number of theoretical plates) and limit of detection showed that the methods give precise results. The technique of MEEKC was also used for the separation of ephedrine derivatives. By means of a HDAS-β-CD-modified CZE method, Wedig et al. achieved baseline separation of racemic ephedrine, pseudoephedrine, N-methylephedrine and norephedrine in one run. In their experiment the BGE consisted of 50 mM phosphate buffer, pH 3.0. An ME was composed of this buffer as aqueous phase and the organic compounds, which formed the oil-phase of the ME for the amino acids. Contrary to the CZE method of Wedig et al., who used HDAS-β-CD, no satisfying resolution was observed. Replacing the chiral selector HDAS-β-CD with sulf. β-CD and modifying the phosphate buffer in ionic strength and pH value, led to baseline separation of the four mentioned ephedrine derivatives eventually. This MEEKC method was subjected to the separation of other ephedrine derivatives. So racemic 2-(dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol could partly be separated, whereas complete separation could be observed for racemic adrenaline, 2-amino-1-phenylethanol and diethylnorephedrine. Whereas the MEEKC method is much cheaper by using sulf. β-CD, the application of the HDAS-modified CZE method resulted in the separation of all four racemic ephedrine alkaloids in one run. Finally, an impurity analysis of quetiapine and its related compounds quetiapine desethanol, quetiapine-N-oxide and quetiapine lactam was develop. The molecular structure of quetiapine lactam needed to be clarified, as this compound had not been described before. By using mass spectrometric (MS) as well as infrared (IR) and NMR investigations, the substance could be identified: Dibenzo[b,f][1,4]thiazepine-11(10H)one. As quetiapine lactam was found to be nearly insoluble in water and aqueous solutions, an NACE method had to be applied. Indeed, a method was developed with a BGE consisting of methanol, acetonitril, ammonium acetate and acetic acid. Thereby, the separation of quetiapine and its three mentioned impurities was observed with high resolution values. However, validation was impossible, because of numerous aborts of the current. Alternatively, an aqueous and highly reproducible CZE method was found with a BGE composed of 80 mM phosphate buffer, pH 4.0. Due to the water insolubility of quetiapine lactam, only quetiapine desethanol and quetiapine-N-oxide could be analysed as impurities. Finally, the aqueous CZE method was validated; the high precision of the results could be verified.