A Terapia Fotodinâmica é um tratamento promissor no cura de várias doenças oftalmológicas e dermatológicas, assim como tumores. Este tratamento utiliza a combinação de luz e um composto fotossensível na presença de oxigênio. Neste trabalho objetivamos entender mecanismos de fotossensibilização em membranas. Para isso, estudamos os efeitos de irradiação em Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) compostas de POPC e Cardiolipina (CL) e POPC e Colesterol (Col), contendo uma molécula fotoativa (diC12-porf) ancorada à superfície dessas membranas. GUVs compostas por POPC e POPC:Col na presença da molécula fotoativa reagem ao estímulo da luz exibindo um aumento de área seguido de flutuações. O mesmo foi observado para membranas de POPC contendo menos que 50mol% de CL. Já para composições contendo 50mol% de CL, a membrana passa a formar domínios lipídicos podendo ou não ser destruída durante a irradiação. Estes domínios podem ser suprimidos com a adição de EDTA (agente quelante de íons divalentes) na solução. Ao adicionarmos CaCl2 ao meio externo das GUVs contendo EDTA, percebemos que o efeito dos domínios e destruição da membrana reaparece. Tal fato evidencia que íons Ca++ presentes em solução devem complexar com as cargas da CL, levando à formação de domínios lipídicos. Ao quantificar o aumento de área sofrido pelas membranas percebemos que a presença de CL na membrana de POPC inibe o aumento de área para concentrações acima de 40mol% de CL. Já a presença de Col na membrana parece não contribuir significativamente para o aumento de área, embora o mesmo sofra oxidação. Além disso, evidenciou-se que na presença de CL/Col o tempo de fotoclareamento de diC12-porf é muito maior do que na ausência destes. Estes resultados evidenciam que a inclusão de CL na membrana oferece um número maior de sítios de reação para o oxigênio singlete reduzindo a foto-degradação da molécula fotoativa. Já a inclusão de Col aumenta o tempo de vida da molécula fotoativa provavelmente devido ao fato da dupla ligação do Col estar mais próxima ao centro produtor de oxigênio singlete do que a dupla ligação do POPC. / Photodynamic Therapy is a promising treatment for the cure of many diseases, like tumors. This treatment uses a combination of light and a photosensitive molecule in the presence of oxygen. In this way, our objective is to understand photosensibilization mechanisms on membranes. For this purpose, we studied the effects of irradiation in Giant Unilamelar Vesicles (GUVs) composed of POPC and Cardiolipin (CL) and POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of a photosensitive molecule (diC12-porf). When the GUVs composed of POPC or POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of the photosensitive molecule were irradiated, increase in surface area followed by fluctuations was observed. For GUVs composed of low concentrations of CL, the membrane photo-response was similar to that observed for pure POPC. For GUVs composed of 50 mol% CL different responses to light irradiation were observed. Some lipid domains appear for GUVs in water under irradiation and the GUV might be destroyed. When the irradiation was done in the presence of EDTA (chelant agent), the formation of the domains was prevented. Further addition of CaCl2 to this solution induced the formation of domains again leading eventually to membrane disruption. These results suggest that divalent cations have effect on the binding to CL negative polar heads, favoring lipid domain formation. We quantified the area increase obtained for the GUVs. For GUVs composed of CL we observed that until 40mol% of CL, the maximum expansion reached by the membrane area was similar to that obtained for pure POPC. For 50mol% of CL the increase of area is smaller than that found for GUVs composed only by POPC. For GUVs composed of Chol the behavior of the area is similar to that found for POPC. This means that the increase of area is mainly related to POPC peroxidation, although Chol hydroperoxide must be concomitantly formed too. Further, we observed that the diC12-porf photobleaching characteristic time for GUVs composed of CL/Chol is greater than that noted for GUVs composed of POPC. This means that when we introduce CL we are increasing the possibilities of reaction of the singlet oxygen and the photosensitive molecule is protected. The insertion of Chol in the membrane also protects the photosensitive molecule.

Neste trabalho, estudamos a interação de um peptídeo antimicrobiano com membranas modelo, por meio de dicroísmo circular (CD), fluorescência e microscopia óptica. Tal peptídeo, chamado de híbrido, foi sintetizado como uma mistura das regiões mais ativas de dois outros peptídeos antimicrobianos, chamados de pediocina A e plantaricina 149. Esse peptídeo híbrido possui carga de +8, em pH fisiológico, e as membranas estudadas foram compostas por uma mistura de fosfolipídeos zwiteriônicos (cabeça polar de fosfatidilcolina, PC) e aniônicos (cabeça polar de fosfatidilglicerol, PG), em diferentes razões molares. Os resultados de CD evidenciaram que este peptídeo se apresenta de forma desordenada em solução aquosa, porém adota uma conformação helicoidal na presença de grandes vesículas unilamelares carregadas negativamente (LUVs). A quantidade de componente helicoidal é dependente da quantidade de lipídeo negativo presente na bicamada lipídica. A fluorescência do triptofano revelou um deslocamento para o azul muito significativo, chegando a 20 nm para membranas compostas por 100 mol% de PG. Os dois resultados (CD e fluorescência) indicam que a região dos aminoácidos que contém o triptofano deve estar interagindo muito fortemente com a região hidrofóbica da membrana, numa conformação tipo-helicoidal. Experimentos de vazamento de carboxifluoresceína encapsulada em LUVs, por espectroscopia de fluorescência, demonstraram a ação lítica do peptídeo induzindo a formação de poros nas membranas, independentemente da composição das LUVs. Entretanto, a razão molar peptídeo:lipídeo necessária para induzir vazamento da sonda foi menor para membranas lipídicas compostas por bicamadas contendo altas quantidades de PG. Tal fato coloca em evidência o papel fundamental da interação eletrostática entre os peptídeos carregados positivamente com as membranas carregadas negativamente para o processo de ligação e mecanismo de ação deste peptídeo. Para estudar mais detalhadamente o mecanismo de ação, realizamos experimentos de microscopia óptica em vesículas unilamelares gigantes. Concluímos que o peptídeo provoca total desestabilização das vesículas unilamelares gigantes, com formação de poros, seguidos de ruptura da bicamada lipídica e sua transformação em pequenos e mal definidos complexos de peptídeos e fosfolipídeos. / In this work, we investigated the interaction between an antibacterial peptide with model membranes, by means of circular dichroism (CD), fluorescence and optical microscopy. Such a peptide was synthesized from the most active regions of two others antimicrobial peptides, namely pediocin A and plantaricin 149. The hybrid peptide has a net charge of ~ +8, at physiological pH, and the studied model membranes were composed of a mixture of zwitterionic phospholipids (phosphatidylcholine polar head) and anionic phospholipids (phosphatidylglycerol polar head), at differente molar ratio. The CD results evidenced that the peptide was essentially structureless in aqueous solution, but acquired an helical conformation in the presence of charged large unillamellar vesicles LUVs. The helical content is dependent on the negative charge amount on membrane surface. The tryptophan fluorescence revealed a significant blue shift of the maximium emission wavelength, up to 20 nm for the membranes composed of 100 mol% of PG in respect to the peptide fluorescence in the aqueous solution. This indicates that part of the aminoacid residues, that contains the tryptophan, must be buried into the hydrophobic medium of the lipid membrane. Leakage experiments using fluorescence spectroscopy of carboxyfluorescein encapsulated in LUVs demonstrated the lytic action of the peptide, inducing the pore formation in the membrane, regardless of lipid membrane composition. However, it should be stressed that the peptide:lipid molar ratio necessary to induce probe leakage was smaller for lipid membranes made up of large PG amounts. Such evidence points out the key role of the electrostatic interaction between a positively charged peptide and the negatively charged membrane, mediated by hydrophobic contribution. To gain further insight into the lytic mechanism of the peptide, we performed single vesicle experiments using giant unilamellar vesicles under optical microscopy observations. We conclude that the peptide provokes a total membrane desestabilization, with pore formation, followed by a membrane disruption and its transformation into smaller and not well defined complexes of phospholipids and peptides.

A Terapia Fotodinâmica é um tratamento promissor no cura de várias doenças oftalmológicas e dermatológicas, assim como tumores. Este tratamento utiliza a combinação de luz e um composto fotossensível na presença de oxigênio. Neste trabalho objetivamos entender mecanismos de fotossensibilização em membranas. Para isso, estudamos os efeitos de irradiação em Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) compostas de POPC e Cardiolipina (CL) e POPC e Colesterol (Col), contendo uma molécula fotoativa (diC12-porf) ancorada à superfície dessas membranas. GUVs compostas por POPC e POPC:Col na presença da molécula fotoativa reagem ao estímulo da luz exibindo um aumento de área seguido de flutuações. O mesmo foi observado para membranas de POPC contendo menos que 50mol% de CL. Já para composições contendo 50mol% de CL, a membrana passa a formar domínios lipídicos podendo ou não ser destruída durante a irradiação. Estes domínios podem ser suprimidos com a adição de EDTA (agente quelante de íons divalentes) na solução. Ao adicionarmos CaCl2 ao meio externo das GUVs contendo EDTA, percebemos que o efeito dos domínios e destruição da membrana reaparece. Tal fato evidencia que íons Ca++ presentes em solução devem complexar com as cargas da CL, levando à formação de domínios lipídicos. Ao quantificar o aumento de área sofrido pelas membranas percebemos que a presença de CL na membrana de POPC inibe o aumento de área para concentrações acima de 40mol% de CL. Já a presença de Col na membrana parece não contribuir significativamente para o aumento de área, embora o mesmo sofra oxidação. Além disso, evidenciou-se que na presença de CL/Col o tempo de fotoclareamento de diC12-porf é muito maior do que na ausência destes. Estes resultados evidenciam que a inclusão de CL na membrana oferece um número maior de sítios de reação para o oxigênio singlete reduzindo a foto-degradação da molécula fotoativa. Já a inclusão de Col aumenta o tempo de vida da molécula fotoativa provavelmente devido ao fato da dupla ligação do Col estar mais próxima ao centro produtor de oxigênio singlete do que a dupla ligação do POPC. / Photodynamic Therapy is a promising treatment for the cure of many diseases, like tumors. This treatment uses a combination of light and a photosensitive molecule in the presence of oxygen. In this way, our objective is to understand photosensibilization mechanisms on membranes. For this purpose, we studied the effects of irradiation in Giant Unilamelar Vesicles (GUVs) composed of POPC and Cardiolipin (CL) and POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of a photosensitive molecule (diC12-porf). When the GUVs composed of POPC or POPC and Cholesterol (Chol) in the presence of the photosensitive molecule were irradiated, increase in surface area followed by fluctuations was observed. For GUVs composed of low concentrations of CL, the membrane photo-response was similar to that observed for pure POPC. For GUVs composed of 50 mol% CL different responses to light irradiation were observed. Some lipid domains appear for GUVs in water under irradiation and the GUV might be destroyed. When the irradiation was done in the presence of EDTA (chelant agent), the formation of the domains was prevented. Further addition of CaCl2 to this solution induced the formation of domains again leading eventually to membrane disruption. These results suggest that divalent cations have effect on the binding to CL negative polar heads, favoring lipid domain formation. We quantified the area increase obtained for the GUVs. For GUVs composed of CL we observed that until 40mol% of CL, the maximum expansion reached by the membrane area was similar to that obtained for pure POPC. For 50mol% of CL the increase of area is smaller than that found for GUVs composed only by POPC. For GUVs composed of Chol the behavior of the area is similar to that found for POPC. This means that the increase of area is mainly related to POPC peroxidation, although Chol hydroperoxide must be concomitantly formed too. Further, we observed that the diC12-porf photobleaching characteristic time for GUVs composed of CL/Chol is greater than that noted for GUVs composed of POPC. This means that when we introduce CL we are increasing the possibilities of reaction of the singlet oxygen and the photosensitive molecule is protected. The insertion of Chol in the membrane also protects the photosensitive molecule.

Neste trabalho, estudamos a interação de um peptídeo antimicrobiano com membranas modelo, por meio de dicroísmo circular (CD), fluorescência e microscopia óptica. Tal peptídeo, chamado de híbrido, foi sintetizado como uma mistura das regiões mais ativas de dois outros peptídeos antimicrobianos, chamados de pediocina A e plantaricina 149. Esse peptídeo híbrido possui carga de +8, em pH fisiológico, e as membranas estudadas foram compostas por uma mistura de fosfolipídeos zwiteriônicos (cabeça polar de fosfatidilcolina, PC) e aniônicos (cabeça polar de fosfatidilglicerol, PG), em diferentes razões molares. Os resultados de CD evidenciaram que este peptídeo se apresenta de forma desordenada em solução aquosa, porém adota uma conformação helicoidal na presença de grandes vesículas unilamelares carregadas negativamente (LUVs). A quantidade de componente helicoidal é dependente da quantidade de lipídeo negativo presente na bicamada lipídica. A fluorescência do triptofano revelou um deslocamento para o azul muito significativo, chegando a 20 nm para membranas compostas por 100 mol% de PG. Os dois resultados (CD e fluorescência) indicam que a região dos aminoácidos que contém o triptofano deve estar interagindo muito fortemente com a região hidrofóbica da membrana, numa conformação tipo-helicoidal. Experimentos de vazamento de carboxifluoresceína encapsulada em LUVs, por espectroscopia de fluorescência, demonstraram a ação lítica do peptídeo induzindo a formação de poros nas membranas, independentemente da composição das LUVs. Entretanto, a razão molar peptídeo:lipídeo necessária para induzir vazamento da sonda foi menor para membranas lipídicas compostas por bicamadas contendo altas quantidades de PG. Tal fato coloca em evidência o papel fundamental da interação eletrostática entre os peptídeos carregados positivamente com as membranas carregadas negativamente para o processo de ligação e mecanismo de ação deste peptídeo. Para estudar mais detalhadamente o mecanismo de ação, realizamos experimentos de microscopia óptica em vesículas unilamelares gigantes. Concluímos que o peptídeo provoca total desestabilização das vesículas unilamelares gigantes, com formação de poros, seguidos de ruptura da bicamada lipídica e sua transformação em pequenos e mal definidos complexos de peptídeos e fosfolipídeos. / In this work, we investigated the interaction between an antibacterial peptide with model membranes, by means of circular dichroism (CD), fluorescence and optical microscopy. Such a peptide was synthesized from the most active regions of two others antimicrobial peptides, namely pediocin A and plantaricin 149. The hybrid peptide has a net charge of ~ +8, at physiological pH, and the studied model membranes were composed of a mixture of zwitterionic phospholipids (phosphatidylcholine polar head) and anionic phospholipids (phosphatidylglycerol polar head), at differente molar ratio. The CD results evidenced that the peptide was essentially structureless in aqueous solution, but acquired an helical conformation in the presence of charged large unillamellar vesicles LUVs. The helical content is dependent on the negative charge amount on membrane surface. The tryptophan fluorescence revealed a significant blue shift of the maximium emission wavelength, up to 20 nm for the membranes composed of 100 mol% of PG in respect to the peptide fluorescence in the aqueous solution. This indicates that part of the aminoacid residues, that contains the tryptophan, must be buried into the hydrophobic medium of the lipid membrane. Leakage experiments using fluorescence spectroscopy of carboxyfluorescein encapsulated in LUVs demonstrated the lytic action of the peptide, inducing the pore formation in the membrane, regardless of lipid membrane composition. However, it should be stressed that the peptide:lipid molar ratio necessary to induce probe leakage was smaller for lipid membranes made up of large PG amounts. Such evidence points out the key role of the electrostatic interaction between a positively charged peptide and the negatively charged membrane, mediated by hydrophobic contribution. To gain further insight into the lytic mechanism of the peptide, we performed single vesicle experiments using giant unilamellar vesicles under optical microscopy observations. We conclude that the peptide provokes a total membrane desestabilization, with pore formation, followed by a membrane disruption and its transformation into smaller and not well defined complexes of phospholipids and peptides.