Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabianoMT.pdf: 637738 bytes, checksum: 985b4ebc65a8511464495683b08649e2 (MD5) Previous issue date: 2006-06-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Globulins fractions of legume seeds of Crotalaria pallida, Erytrina veluntina and Enterolobium contortisiliquum were isolated and submitted to assays against serine, cysteine and aspartic proteinases, as also amylase present in midgut of C. maculatus and Z. subfasciatus. Hemagglutination assays indicated presence of a lectin in E. veluntina globulin fractions. This lectin had affinity to human erythrocytes type A, B and O. Vicilins were purified by chromatography on Sephacryl S-300 followed of a chromatography on Sephacryl S-200, which was calibrated using protein markers. Vicilins from C. pallida (CpV) and E. veluntina (EvV) seeds had a molecular mass of 124.6 kDa and E. contortisiliquum a molecular mass of 151kDa. Eletrophoresis in presence of SDS showed that CpV was constituted by four subunities with apparent molecular mass of 66, 63, 57 and 45 kDa, EvV with three subunities with apparent molecular mass of 45kDa and EcV four subunities, two with 37.1 kDa and two with 25.8 kDa. Non denaturantig eletrophoresis displayed single bands with high homogeneity, where CpV had lower acidic behavior. All vicilins are glycoproteins with carbohydrate contents at 1 to1.5%. Bioassays were done to detect deleterious effects of vicilins against C. maculatus and Z. subfasciatus larvae. CpV, EvV and EcV exhibited a WD50 of 0.28, 0.19 and 1.03%; LD50 0.2, 0.26, and 1.11% respectively to C. maculatus. The dose responses of CpV, EvV and EcV to Z. subfasciatus were: WD50 of 0.12, 0.14, 0.65% and LD50 of 0.09, 0.1, and 0.43% respectively. The mechanism of action of these proteins to bruchids should be based on their properties of bind to chitin present in mid gut of larvae associated with the low digestibility of vicilin. In assays against phytopatogenous fungus, only EcV was capable of inhibit F. solani growth at concentrations of 10 and 20 ?g and its action mechanism should be also based in the affinity of EcV to chitin present in the fungi wall / Sementes de leguminosas das esp?cies Crotalaria pallida, Erythrina veluntina e Enterolobium contortisiliquum tiveram suas fra??es globul?nicas isoladas. As globulinas n?o apresentaram atividade de inibidores para as enzimas tipo ser?nicas, ciste?nicas, asp?rticas e para as amilases de homogenatos intestinais de larvas de Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus. Os testes de atividades hemaglutinantes indicaram que apenas a globulina de Erytrina veluntina apresentou contamina??o com lectinas com afinidade para eritr?citos humanos do tipo A, B e O. As vicilinas foram ent?o purificadas usando-se duas cromatografias de filtra??o em gel, Sephacryl S-300 seguido de uma Sephacryl S-200 calibrada com marcadores de massa molecular conhecidos. Vicilinas de C. pallida (CpV) e E. veluntina (EvV) apresentaram massa molecular de 124,6 kDa e a de E. contortisiliquum (EcV) com massa molecular de 151 kDa..Eletroforese desnaturante mostrou que CpV possui 4 subunidades de massas moleculares aparentes de 66, 63, 57, 45 kDa; a de EvV com duas subunidades de massa molecular aparente de 66,2 e 63,8 kDa e EcV tr?s subunidades de massa molecular aparente de 54,9 kDa. Essas prote?nas mostraram ser homog?neas por eletroforese nativa com bandas ?nicas, onde CpV revelou ser a prote?na menos ?cida. Todas as vicilinas s?o glicoprote?nas,com conte?do de carboidrato variando de 1 a 1,5%. Bioensaios foram feitos para determinar o efeito delet?rio das vicilinas para C. maculatus e Z. subfasciatus. Cpv, EvV e EcV apresentaram WD50 de 0,28, 0,19 e 1,03%; LD50 de 0,2, 0,26 e 1,11% para C. maculatus, respectivamente . As curvas dose resposta para Cpv, EvV e EcV para Z. subfasciatus apresentou WD50 de 0,12, 0,14 e 0,65%; e LD50 de 0,09, 0,10 e 0,43%, respectivamente. Ensaios digest?rios utilizando se enzimas dos intestinos m?dio de bruqu?deos mostraram que as vicilinas s?o resistentes ? prote?lise, dentre elas destaca-se EcV, que mesmo depois de incubadas por 24 horas n?o foram hidrolisados pelas enzimas de de C. maculatus. Nos ensaios para fungos fitopat?genos apenas EcV foi capaz de inibir a germina??o de esporos de Fusarium solani ? concentra??o de 10 e 20 ?g. O mecanismo de a??o proposto para as vicilinas foi baseado na propriedade que essas prote?nas tiveram de se ligarem a quitina ou estruturas quitinosas presentes nos intestinos m?dios das larvas associado ? baixa digestibilidade destas prote?nas para enzimas dos insetos

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-01-13T13:01:42Z No. of bitstreams: 1 PatriciaBatistaBarraMedeirosBarbosa_TESE.pdf: 3182319 bytes, checksum: 19636ea3271cce1b1b4e72c5e6dfa49c (MD5) / Approved for entry into archive by Elisangela Moura (lilaalves@gmail.com) on 2016-01-25T12:17:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PatriciaBatistaBarraMedeirosBarbosa_TESE.pdf: 3182319 bytes, checksum: 19636ea3271cce1b1b4e72c5e6dfa49c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T12:17:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PatriciaBatistaBarraMedeirosBarbosa_TESE.pdf: 3182319 bytes, checksum: 19636ea3271cce1b1b4e72c5e6dfa49c (MD5) Previous issue date: 2014-06-09 / A dengue ? a mais importante arbovirose da atualidade, sendo transmitida pela picada do mosquito Aedes aegypti. A aus?ncia de uma vacina profil?tica torna o controle da dengue pautado principalmente no controle do inseto vetor. Todavia os crescentes relatos de resist?ncia e os danos ambientais causados pelos inseticidas qu?micos t?m tornado urgente ? busca por alternativas seguras. Foram preparados 21 extratos brutos (EB) de sementes de plantas da Caatinga. Como extrator foi utilizado o fosfato de s?dio 50mM pH 8.0. Os extratos foram utilizados em bioensaios Aedes aegypti, ensaios de toxicidade e submetidos a uma caracteriza??o parcial para identificar a presen?a de mol?culas bioativas. As an?lises inseticidas foram realizadas por probit e as diferen?as entre os grupos foram constatada por Student?s t-test e ANOVA. Todos os extratos apresentaram atividade larvicida para L1 e L4 e, com exce??o do extrato de G. americana, levaram ao ?bito 100% das larvas (48h). Os EB de M. urundeuva, P. viridiflora, E. velutina, A. cearenses e E. contortisiliquum apresentaram os melhores resultados larvicidas. Do mesmo modo, todos os EB foram repelentes para a postura das f?meas gr?vidas. Os EB de D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses, C. ferrea e C. retusa foram capazes de atrair as f?meas para a posturas quando em baixas concentra??es. Na concentra??o atrativa o EB de E. contortisiliquum foi capaz de levar a ?bito 52% das larvas L1 em 48 h, enquanto que o EB de A. cearenses resultou na morte de 100% dessas larvas em 24h. Os extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva e S. brasiliensis tiveram atividade pupicida, enquanto que os extratos de P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum, A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora, B. cheilantha, S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana tiveram a??o adulticidas. Todos os extratos apresentaram toxicidade para C. dubia e os EB de E. velutina e E. contortisiliquum n?o interferiram na viabilidade dos fibroblastos. Considerando todos os ensaios biol?gicos os extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva foram considerados os mais promissores. Em todos os extratos foram identificadas pelo menos duas prote?nas com potencial. O EB de E. contortisiliquum foi selecionado para ser fracionando, j? que n?o apresentou atividade pupicida, indicando que seu mecanismo de a??o larvicida e adulticida resultou da ingest?o de compostos ativos pelos insetos. Al?m disso, esse extrato apresentou o maior teor de prote?na (22 mg/mL) e a maior atividade inibit?ria para as tripsinas das larvas de A. aegypti. Como observado para o EB, as fra??es proteicas de E. contortisiliquum, tamb?m apresentaram atividade larvicida, mas n?o foram pupicida, com destaque para F2 que apresentou maio atividade larvicida e menor toxicidade ambiental do que o EB de origem. A redu??o na atividade proteol?tica das larvas alimentadas com o EB e as fra??es de E. contortisiliquum sugeriu que inibidores de tripsina seriam os respons?vel pela atividade larvicida. Embora o aumento na purifica??o de um inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc) tenha resultado na perda da atividade larvicida, foi constatado que sua aus?ncia reduziu a efic?cia das fra??es, indicando que o ITEc contribui, mas n?o ? suficiente para a atividade larvicida do EB de E. contortisiliquum. Tamb?m n?o foi verificada atividade larvicida e adulticida na fra??o rica em vicilina, e nem evid?ncias da contribui??o dessa mol?cula para a atividade inseticida desse extrato. Os resultados mostram o potencial dos extratos salinos de sementes de planta da Caatinga e, em especial do EB e da F2 de E. contortisiliquum, no controle da popula??o de A. aegypti e indicam que a efic?cia desses extratos deve resultar da a??o conjunta de diferentes compostos ativos, inclusive de natureza proteica, que atuando em diferentes mecanismos s?o capazes de comprometer a viabilidade dos insetos e retardar o surgimento de resist?ncias. / Dengue fever, currently the most important arbovirus, is transmitted by the bite of the Aedes aegypti mosquito. Given the absence of a prophylactic vaccine, the disease can only be controlled by combating the vector insect. However, increasing reports of resistance and environmental damage caused by insecticides have led to the urgent search for new safer alternatives. Twenty - um plant s eed extracts from the Caatinga were prepared , tested and characterized . Sodium phosphate ( 50 mM pH 8.0) was used as extractor. All extracts showed larvicidal and ovipositional deterrence activity . Extracts of D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses , C. ferrea and C. retusa were able to attract females for posture when in low co ncentration . In the attractive concentrations, the CE of E. contortisiliquum and A. cearenses were able to kill 52% and 100% of the larvae respectively . The extracts of A. cearenses , P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis were also pupicides, while extracts of P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum , A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora , B. cheilantha , S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana displayed adulticidal activity. All extracts were toxic to C. dubia zooplankton . The EB of E. velutina and E. contortisiliquum did not affect the viability of fibroblasts . In all extracts were identified at least two potential insecticidal proteins such as enzyme inhibitors, lectins and chitin - binding proteins and components of secondary metabolism . Considering all bioassays , the extracts from A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum , S. brasiliensis, E. velutina and M. urundeuva were considered the most promising . The E. contortisiliquum extracts was the only one who did not show pupicida activity, indicating that its mechanism of action larvicide and adulticidal is related only to the ingesti on of toxic compounds by insect , so it was selected to be fragmenting. As observed for the CE , th e protein fractions of E. contortisiliquum also showed larvicidal activity, highlighting that F2 showed higher larvicidal activity and lower en vironmental toxicity than the CE source. The reduction in the proteolytic activity of larvae fed with crude extra ct and fractions of E. contortisiliquum suggest ed that the trypsin inhibitors ( ITEc) would be resp onsible for larvicidal activity . However the increase in the purification of this inhibitor resulted in loss of larvicidal activity , but the absence of trypsin inhibitor reduced the effectiveness of the fractions , indicating that the ITEC contributes to the larvicidal activity of this extract. Not been observed larvicidal activity and adulticide in rich fraction vicilin, nor evidence of the contribution o f this molecule for the larvicidal activity of the extract. The results show the potential of seeds from plant extracts of Caatinga as a source of active molecules against insects A. aegypti at different stages of its development cycle, since they are comp osed of different active compounds, including protein nature, which act on different mechanisms should result in the death of insec

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CleysyvanSM_DISSERT.pdf: 1173359 bytes, checksum: 82a094c436e4d9b81948c390ed5d9ed1 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Chitin-binding vicilins from legume seeds (Erythrina velutina. Canavalia ensiformes and Phaseolus vulgares) were isolated by ammonium sulfate followed by affinity chromatography on a chitin column. Effect of these vicilins on female adults of Ceratitis capitata was examined by bioassay and in a semi-field assay model. Mechanism of action of the vicilins was determined by in vivo digestibility and chitin affinity. Among the tested vicilins, E. velutina when added to diet caused strong effect on mortality at 10% dose. This insecticidal property was tested in a semi-field assay which showed the same effect observed in laboratory conditions, where doses of 10% and 15% were lethal to female adults of C. capitata. These deleterious effects were not only associated to the binding to chitin structures present in peritrophic membrane, but principally to its low digestibility in the C. capitata digestive tract. This fact was confirmed because chiting binding proteins as WGA and the other tested vicilins were not toxic to female adults of C. capitata due susceptibility of these proteins to digestive enzymes of the insects. By other side EvV was more resistant to digestive enzymes, causing deleterious effects on female adults of C. capitata. These results showed that EvV may be part of the pest management programs or an alternative in plant improvement program in the population control of this fruticulture pest / Vicilinas ligantes a quitina de sementes de Erythrina velutina, Canavalia ensiformis e Phaseoulus vulgaris foram isoladas atrav?s de procedimento que consistiu de precipita??o com sulfato de am?nio seguida de cromatografia de afinidade em coluna de quitina. O efeito dessas vicilinas sobre f?meas adultas de Ceratitis capitata foi examinada por bioensaios em condi??es de laborat?rio e por bioensaios em condi??es de semi-campo. O mecanismo de a??o dessas vicilinas foi determinado por um ensaio de digestibilidade in vivo e pela propriedade de liga??o a uma matriz de quitina. Entre as vicilinas testadas, a vicilina de E. velutina foi a ?nica letal, causando mortalidade de 100% quando adicionada ? dieta das moscas das frutas adultas na concentra??o de 10% (p/p). Este efeito inseticida da vicilina de E. velutina foi tamb?m testado em condi??es de semi-campo, onde concentra??es de 10 % e 15% (p/p) de vicilina adicionada ? dieta foram letais para f?meas adultas de C. capitata. Esse efeito delet?rio das prote?nas ligantes ? quitina n?o foi associado somente ? propriedade de liga??o ? quitina, visto que as outras vicilinas, al?m da lectina de g?rmen de trigo (WGA) foram t?xicas quando adicionadas ? dieta das moscas das frutas. Entretanto, a resist?ncia/susceptibilidade dessas prote?nas aos processos digest?rios desses insetos poderia explicar os diferentes efeitos observados. Das prote?nas ligantes ? quitina, apenas aquelas refrat?rias ? a??o das enzimas digestivas nos processos digest?rios teve a??o inseticida. Esses resultados mostraram que vicilina de E. velutina ? um bioinseticida com potencial de uso nos programas de controle de pragas diminuindo a popula??o de moscas das frutas no campo