Les héparanes sulfate (HS) sont des polysaccharides complexes appartenant à la famille des glycosaminoglycanes (GAGs), présents en abondance à la surface cellulaire et dans les matrices interstitielles. De par leur positionnement stratégique à l'interface entre la cellule et son micro-environnement et leur capacité à fixer et moduler l'activité d'un très grand nombre de protéines, les HS sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Les travaux présentés viseront à illustrer l'importance biologique de ces polysaccharides et de leurs interactions avec les protéines, principalement dans les domaines des relations hôtes-pathogènes et des processus inflammatoires. Ils s'attacheront également à montrer les difficultés que présente l'étude de ces molécules, ainsi que les méthodologies développées afin de faciliter leur caractérisation structurale et fonctionnelle. Enfin, des perspectives de recherche seront proposées, visant à intégrer les études en cours dans un contexte physiologique, par l'analyse des HS exprimés par les cellules. La structure des HS, et donc leurs propriétés biologiques, varie en effet de manière considérable selon le type cellulaire étudié, son niveau d'activation ou de différenciation. La réponse cellulaire à des stimuli externes (protéines de signalisation, cytokines pro-inflammatoires, molécules intervenant dans la reconnaissance hôte/pathogènes...) est donc intimement liée au " paysage glycanique" présent à sa surface et à sa capacité à moduler ce paysage. La compréhension de ces mécanismes représente donc un enjeu évident pour l'étude de nombreuses fonctions cellulaires.

La préservation d'un stock de cellules souches fonctionnelles est indispensable pour le maintien de nombreux tissus chez l'adulte. Les cellules souches se multiplient pour s'auto-renouveller et entrent en différenciation donnant naissance à des progéniteurs puis à des cellules matures. Récemment, la possibilité pour les progéniteurs de se reprogrammer en cellules souches et de réacquérir un potentiel de régénération à long terme a été suggérée notamment dans le tissu germinal. Ainsi, l'auto-renouvellement et la reprogrammation des progéniteurs pourraient jouer un rôle dans le maintien du pool de cellules souches. Mon travail de thèse portait sur l'étude de ces deux mécanismes de régénération des cellules souches chez la souris. J'ai tout d'abord étudié la reprogrammation des progéniteurs germinaux au cours de la spermatogenèse. Ce travail montre la capacité des progéniteurs germinaux mâles, les spermatogonies différenciées, à modifier leur programme de différenciation et à générer de nouvelles cellules souches germinales après transplantation testiculaire. Les progéniteurs germinaux pourraient ainsi constituer une réserve de " cellules souches potentielles ". Le tissu germinal possède donc une certaine plasticité. La seconde partie de mon travail porte sur l'implication du gène Fancg de l'anémie de Fanconi, voie de réponse aux dommages à l'ADN, dans l'auto-renouvellement et la fonctionnalité des cellules souches hématopoïétiques au cours de l'hématopoïèse. L'intégrité génétique des cellules souches doit en effet être préservée tout au long de la vie de l'individu. Cette étude montre que l'invalidation du gène Fancg perturbe le processus de migration, la quiescence, et la régulation de l'expression de certains gènes clés des fonctions des cellules souches. Ces altérations participent au déficit fonctionnel des cellules souches hématopoïétiques observées dans le modèle murin Fancg-/-.

L'organisme est exposé à divers agents infectieux et doit mettre en place une réponse immunitaire adéquate pour se protéger. Mes travaux de thèse m'ont permis d'étudier la réponse innée à l'infection par Listeria monocytogenes (L.m) et l'inflammation pulmonaire induite par la flagelline extraite de Salmonella typhimurium. Mes résultats ont mis en évidence l'association du co-récepteur CD14 avec TLR2 (Toll-like Receptor 2) dans la détection de L.m injectée par voie veineuse. En revanche, CD14 ne semble pas être associé au TLR5 dans la reconnaissance de la flagelline. Par ailleurs, l'activation des TLR par leurs ligands permet la synthèse de cytokines intervenant dans l'inflammation. J'ai ainsi pu étudier plus précisément le TNF (Tumor Necrosis Factor). Cette protéine pro-inflammatoire est un des médiateurs principaux de l'immunité et existe sous une forme membranaire qui a été peu étudiée (Mem-TNF) et sous une forme soluble bien connue (sTNF). Mes études ont montré que ce Mem-TNF active la production de cytokines et de médiateurs chimiques de l'inflammation conférant une protection partielle contre Listéria. L'étude de cette cytokine membranaire nous a permis de tester une nouvelle génération de traitements moins agressifs que les anti-TNF contre l'arthrite rhumatoïde ou la maladie de Crohn.

Chez les eucaryotes, la transcription de l'information génétique en ARN messager (ARNm) est un processus complexe nécessitant de multiples modifications de la molécule d'ARN précurseur. D'après le modèle actuel, l'ARN naissant est recouvert de protéines pour former une particule ribonucléoprotéique (mRNP). Ces étapes de maturation et d'assemblage du transcrit, connues sous le nom de biogénèse des mRNPs, sont physiquement et fonctionnellement couplées à la transcription. Elles assurent l'intégrité ainsi que l'export du transcrit vers le cytoplasme pour y être traduit en protéine. La production du transcrit mature est interconnectée à une étape de contrôle qualité afin d'éviter l'export de transcrits aberrants. Pour identifier de nouveaux facteurs de la biogénèse des mRNPs et comprendre le mode de signalisation des transcrits aberrants, nous avons élaboré un crible innovant. Il repose sur la perturbation de l'expression des gènes de Saccharomyces cerevisiae par le facteur bactérien Rho, capable de dissocier des protéines liées à une molécule d'ARN in vitro. L'expression de Rho chez la levure perturbe l'assemblage nucléoprotéique co-transcriptionnel et génère des transcrits aberrants qui sont dégradés par le système de surveillance nucléaire. Cette étude révèle les interactions dynamiques des facteurs avec le complexe transcriptionnel et leurs implications dans le mécanisme de reconnaissance des transcrits aberrants par la machinerie de dégradation. Notre méthodologie ouvre des perspectives intéressantes pour détecter de nouveaux facteurs de la biogénèse des mRNPs et évaluer leurs rôles dans la régulation de l'expression des gènes.

La mitogaligine est une protéine codée par le gène galig, un gène inducteur de la mort cellulaire. Préalablement, il a été montré au laboratoire que cette protéine mitochondriale pouvait induire la mort cellulaire selon une voie alternative de l'apoptose. Nos études indiquent que la mitogaligine peut également être adressée au noyau où elle exerce aussi une activité cytotoxique. Le signal d'adressage nucléaire est non conventionnel et lié à une répétition d'acides aminés. Il n'est fonctionnel que si le signal de localisation mitochondriale est aboli. La fonction cytotoxique de la mitogaligine pourrait donc être régulée par son adressage subcellulaire. De nombreuses protéines apoptotiques sont régulées par des modifications post-traductionnelles. La mitogaligine possède différents sites de phosphorylation potentiels. Plusieurs d'entre eux ont été mutés afin de mettre en évidence une éventuelle implication de cette fonction dans l'activité de la mitogaligine. La mitogaligine non mutée subit une ou plusieurs coupures protéolytiques. La mutation des résidus thréonines 29 et 73 en résidus phospho-mimétiques diminue cette protéolyse mais aussi la cytotoxicité de la protéine. Le même type de mutations de la thréonine 38 et la sérine 39 provoque une délocalisation de la protéine. La dernière partie de la thèse s'intéresse plus particulièrement à l'interaction fonctionnelle entre la mitogaligine et Mcl-1, une protéine anti-apoptotique de la famille-Bcl-2. La coexpression de galig et Mcl-1 réduit la mort cellulaire induite par l'expression de galig et la surexpression de galig réduit la production endogène de Mcl-1. Ces résultats montrent une implication de galig dans une voie de régulation de l'apoptose. Galig pourrait donc représenter une cible thérapeutique pour restaurer la mort cellulaire dans des cellules surexprimant des protéines antiapoptotiques de la famille Bcl-2.

Les glucocorticoïdes sont des substances très utilisées en thérapeutique, mais parfois détournées de leur utilisation première par les sportifs. Si l'effet ergogénique d'une prise de courte durée de glucocorticoïdes chez l'homme a été démontré, les répercussions de cette prise chez la femme et les mécanismes impliqués restent mal connus. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés aux effets d'une prise de courte durée de prednisone (50 mg/j/7j) lors de la réalisation d'un exercice submaximal jusqu'à épuisement chez des volontaires sains de sexe féminin pratiquant une activité physique régulière. Nous avons mis en évidence une performance significativement améliorée sous glucocorticoïdes, avec des altérations métaboliques et hormonales vs. placebo comparables à celles mises en évidence chez le sujet de sexe masculin. Il apparaît donc qu'il n'existe pas d'effet " genre ", à l'exception toutefois d'une absence d'insulino-résistance sous corticoïdes chez la femme. Dans une deuxième étude effectuée lors d'un exercice de plus longue durée, la prise de prednisone vs. placebo induit en fin d'exercice une augmentation des concentrations d'acides aminés branchés et de la glycémie, pouvant être interprétée comme une augmentation de la néoglycogénèse. Dans une troisième étude, nous avons mis en évidence qu'un traitement d'une semaine de prednisone per os ne semblait altérer l'axe hypothalamo-hypophysosurrénalien que de manière très transitoire, avec un retour à des concentrations basales de cortisol et de DHEA seulement 3 jours après la fin du traitement. Enfin, dans une étude préliminaire effectuée sur modèle animal, grâce au concours du Laboratoire de Neurobiologie, la prednisone semble augmenter la sérotonine et son métabolite chez les souris sédentaires au repos.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare, mais celui qui cause le plus de mortalité. L'étapecritique de sa progression est l'angiogenèse, processus détourné par la tumeur pour s'oxygéner et senourrir. Les cellules tumorales peuvent alors former des métastases dans les ganglions lymphatiques,notamment. D'autre part, la tumeur inhibe les réponses immunitaires de l'hôte à son encontre. Tousces mécanismes font intervenir le monoxyde d'azote (NO ). Le but de ce projet a été d'approfondir lerôle du NO dans l'angiogenèse et le recrutement leucocytaire, mécanismes basés sur lareconnaissance cellulaire de l'endothélium.Nous avons montré que le NO est nécessaire à l'angiogenèse, mais que des doses plus fortes sontanti-angiogéniques. Cet effet inhibiteur peut s'expliquer par la diminution des interactions cellules-cellules,et l'inhibition de l'expression de PECAM-1/CD31, principalement.D'autre part, nous avons établi que l'adhésion des leucocytes est inhibée par le NO ce qui a été reliéà la modulation de l'expression des molécules capables de fixer des chimiokines : lesglycosaminoglycannes et les récepteurs de chimiokines, ainsi qu'à la sous-expression des moléculesd'adhésion CD34, ICAM-2/CD102 et VCAM-1/CD106.En conclusion, le NO est capable de réguler des mécanismes cellulaires majeurs de la progressiontumorale, par modulation de l'expression des molécules de surface de l'endothélium. Tout au long dece travail, nous avons observé que les différences de réponse sont dépendantes des doses de NO etdu type cellulaire, ce qui démontre le rôle pivot du NO dans la progression du cancer.

La lamproie présente un mode de développement de la rétine très particulier parmi les vertébrés. Elle implique deux processus distincts. Le premier conduit à la formation précoce d'une rétine centrale, qui présente des indications de différenciation dès les stades prolarvaires et ne contient que trois types cellulaires différenciés (photorécepteurs, cellules bipolaires et cellules ganglionnaires). Dans un deuxième temps, au cours des stades larvaires, une rétine périphérique, dont dérive l'essentiel de la rétine adulte, se développe à la marge de la rétine centrale. Elle croît de façon importante jusqu'à la métamorphose, au cours de laquelle la différenciation des différents types cellulaires s'effectue. J'ai engagé une analyse des programmes génétiques qui contrôlent ces processus en étudiant les profils d'expression de trois paralogues de la famille Otx (PmOtxA/B/C), ainsi que des gènes PmFoxG1, PmPax6, PmVax2 et PmSix3 au cours du développement précoce de l'oeil, aux stades prolarvaires. L'analyse de l'expression des gènes PmPax6, PmOtxB et PmOtxC a également été étudiée au cours des stades larvaires et dans la rétine différenciée post-métamorphique. Enfin des traitements pharmacologiques visant à inhiber l'activité du récepteur au FGF ont été effectués, en vue d'évaluer le rôle des signalisations médiées par ce récepteur aux stades prolarvaires. Les résultats mettent en évidence un patron de régionalisation de la cupule optique très semblable entre la lamproie et les gnathostomes. Les traitements pharmacologiques suggèrent également des mécanismes de spécification du pédoncule optique conservés à l'échelle des vertébrés. Au cours de la différenciation de la rétine centrale et de la formation de la rétine périphérique, les gènes PmPax6 et PmOtxB/C présentent également une dynamique d'expression globalement conservée, avec quelques différences. Ces analyses fournissent la première caractérisation des programmes génétiques contrôlant la formation de l'oeil chez la lamproie. A la suite de ces analyses, la formation de la rétine centrale apparaît comme un processus accessible aux caractérisations moléculaires et aux analyses fonctionnelles et d'un intérêt majeur à la fois pour des aspects évolutifs et mécanistiques.

Quatre études de liaison génome entier ont mis en évidence une région commune de5,6 Mb dans la région du chromosome 5q15 liée à des traits associés à l'obésité, cette région incluant le gène de la prohormone convertase 1 (PCSK1). Une mutation Pc1 chez la souris a été associée à l'obésité, l'hyperphagie et à une augmentation de l'efficacité du métabolisme. La déficience complète en PCSK1 a été associée à une forme récessive rare d'obésité chezl'homme, et depuis 1997 seuls trois patients présentant cette déficience ont été décrits dans la littérature. Les porteurs de mutations délétères PCSK1 présentent des phénotypes sévères,incluant l'obésité, des hypoglycémies post-prandiales et des problèmes intestinaux ethormonaux. Contrairement aux observations faites chez la souris, les membres des famillesporteurs hétérozygotes ont été considérés comme cliniquement sains. Toutes ces études ontdésigné PCSK1 comme un gène candidat important pour l'obésité.Dans un premier temps, la contribution du gène PCSK1 au risque d'obésitépolygénique a été évaluée chez 13,659 individus d'origine européenne issus de huit cohortescas contrôles ou familiales indépendantes. Neuf variants fréquents couvrant 92% de lavariabilité génétique du locus ont été génotypés. Les méta-analyses des huit études pour levariant commun rs6232 et pour le cluster rs6234-rs6235 ont montré une associationreproductible avec l'obésité chez l'adulte et chez l'enfant (P=7.27x10-8 et P=2.31x10-12respectivement). Le rs6232 était associé à une augmentation du risque d'obésité de 34%, alorsque le cluster rs6234-rs6235 augmentait le risque d'obésité de 22%. Les analysesfonctionnelles ont montré une diminution significative de 10,4% de l'activité catalytique de laprotéine PC1/3 pour le N221D, et une diminution non significative de l'activité catalytique dela protéine PC1/3 pour le cluster Q665E/S690T.L'implication du gène PCSK1 dans l'obésité monogénique a ensuite été entreprise parle séquençage des exons de PCSK1 chez 845 sujets obèses non-consanguins d'origineeuropéenne,. Huit nouvelles mutations non-synonymes ont été identifiées. L'étude des conséquences fonctionnelles des mutations détectées sur la protéine PC1/3 a montré que62.5% de ces mutations détectées étaient prédites délétères par les analyses in silico et 87.5%de ces mutations avaient un effet sur l'auto-activation ou sur l'activité enzymatique de PC1/3in vitro. Dans le but d'estimer le degré de pénétrance pour ces sept mutations pathogéniques,6,060 obèses et 6,274 sujets minces ont été génotypés, démontrant un enrichissement par sixde ces mutations PCSK1 chez les sujets obèses (P=0.007). Cette étude a mis en évidence pourla première fois une augmentation du risque d'obésité chez les porteurs hétérozygotes de mutations perte de fonction du gène PCSK1, confirmant un mode de transmission codominantde l'obésité avec une pénétrance incomplète. La pénétrance de l'obésité a été105estimée à 54.5% pour les porteurs hétérozygotes de mutations délétères PCSK1. Unedéficience partielle en PCSK1 pourrait expliquer environ 0.83% des formes extrêmesd'obésité et représenter la seconde forme la plus fréquente d'obésité monogénique après ladficience en MC4R.Pour conclure, en plus des formes syndromiques très rares d'obésité dues à unedéficience complète en PCSK1, ce travail a permis de démontrer le rôle des variants codantsfréquents non-synonymes dans le risque d'obésité, ainsi que l'importance longtempsinsoupçonné d'une déficience partielle en PCSK1 dans les formes monogéniques d'obésité.

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative, elle représente 70% des formes de démences et affecte près de 860 000 personnes en France. Cette maladie est caractérisée par deux lésions neuropathologiques : les Dégénérescences neurofibrillaires et les Plaques séniles. Ces dernières sont principalement constituées de peptides amyloïdes (Aβ) résultant du clivage d'une protéine membranaire appelée Précurseur du peptide amyloïde (APP). L'étude des formes familiales monogéniques a montré que des mutations des gènes de l'APP et des Présénilines 1 et 2 conduisaient systématiquement à une augmentation de la production d'Aβ. Cette observation a permis l'élaboration de la cascade amyloïde plaçant le métabolisme de l'APP au centre du processus physiopathologique. Même si aujourd'hui ce métabolisme commence à être relativement bien connu, plusieurs zones d'ombres subsistent encore. Dans l'optique de caractériser de nouveaux acteurs intervenant dans ce métabolisme, nous avons émis une hypothèse qui repose sur deux constatations : (i) les protéines impliquées dans l'étiologie de la maladie sont différentiellement exprimées entre les cerveaux des patients et ceux des témoins (ii) dans le cerveau, de nombreuses métalloprotéases participent aux même mécanismes que l'APP (adhésion cellulaire, neuroinflammation, plasticité neuronale...), certaines sont aussi directement actrices du métabolisme de l'APP en tant qu'α-sécrétase (ADAM9, ADAM10 et ADAM17) ou en dégradant l'Aβ (NEP, IDE, MMP2, MMP3 et MMP9). Nous avons donc supposé que les métalloprotéases présentant une différence d'expression entre le tissu cérébral des malades et celui des témoins soient des candidates intéressantes pour moduler le métabolisme et le trafic de l'APP. Une première analyse transcriptomique par biopuce, à partir d'ARN totaux issus des cerveaux de 12 malades et de 12 témoins, nous a permis d'identifier quatre métalloprotéases présentant une différence d'expression significative (p<10-5) : ADAMTS16, ADAM17, ADAM30 et ADAM33. Nous avons cherché à confirmer ce résultat par une autre technologie sur un plus grand nombre d'échantillons (malades n=52 et témoins n=42). Seules ADAM30 et ADAM33 ont pu être validées. Nous avons également pu observer que l'expression d'ADAM30 dans le tissu cérébral des malades est inversement proportionnelle à la quantité d'Aβ42 déposée dans la parenchyme (Aβ42 la forme d'Aβ la plus neurotoxique). De plus, au niveau cérébral, l'expression d'ADAM30 est restreinte aux neurones, cellules sièges du métabolisme de l'APP. Nous avons donc sélectionné ADAM30 comme intervenante potentielle dans le métabolisme de l'APP. Pour tester notre hypothèse, nous avons sous- et sur-exprimé ADAM30 dans deux modèles cellulaires différents. Nous avons mis en évidence que la sur-expression d'ADAM30 entraîne une diminution de l'ensemble des produits du métabolisme de l'APP. En mutant le site catalytique de cette protéase, nous avons remarqué que cette action sur le métabolisme de l'APP est dépendante de cette activité catalytique. De manière cohérente, une sous-expression d'ADAM30 entraîne une augmentation de l'ensemble des produits du métabolisme de l'APP. En utilisant les inhibiteurs alcalisant, nous avons démontré que l'effet d'ADAM30 sur le métabolisme de l'APP met en jeu la dégradation par le lysosome. Des expériences d'immunofluorescence ont attesté qu'ADAM30 est localisée dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi et qu'elle co-localise fortement avec l'APP dans ces organites. Au vu des résultats obtenus durant ces quatre années, nous pensons qu'ADAM30 pourrait être une protéine clé de la régulation de l'APP en inhibant son acheminement jusqu'à la membrane plasmique et en favorisant sa dégradation par le lysosome. [...]