A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação, pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido realizadas baseadas em resultados obtidos sobre as rotas de metabolismo da lisina em plantas e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma. Ambrozevicius (2010) com o objetivo de produzir plantas de milho transgênicas com alto teor de lisina utilizou a estratégia de expressão de proteínas de reserva de outras espécies vegetais ricas em lisina, ou seja, através da expressão de uma proteína heteróloga: a zeolina. O presente trabalho teve como objetivo estudar os 6 eventos transformados expressando a zeolina na geração F3, caracterizando as proteínas de reserva, o perfil de aminoácidos e as enzimas envolvidas no metabolismo de lisina em milho geneticamente modificado, para compreender quais as possíveis alterações bioquímicas podem ter sido geradas pela transformação, e que podem ter levado ao incremento dos aminoácidos essenciais neste material transgênico. O perfil de proteínas de reserva dos eventos transformados exibiu redução na proporção das zeínas II e glutelinas em relação ao controle HiII, e ainda aumentos muito discretos da fração globulina, porém não para todos os eventos transformados. Na composição de aminoácidos solúveis totais foram observados incrementos nos teores dos aminoácidos que fazem parte da via metabólica do ácido aspártico: lisina, metionina, treonina e isoleucina. Para os aminoácidos incorporados em proteínas, foram observados incrementos nos teores de lisina nos eventos transformados da fração globulina e da fração glutelina, ambos em relação ao controle HiII. Já a fração zeína I teve o maior conteúdo total de aminoácidos em todos os eventos transformados. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações em duas enzimas, a primeira enzima envolvida na síntese de lisina, aspartato quinase (AK) e a segunda envolvida na degradação de lisina, lisina cetoglutarato redutase (LOR). Embora as outras enzimas envolvidas na síntese e na degradação de lisina também tenham sido alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Este trabalho mostrou que a expressão da proteína heteróloga zeolina causou alterações na composição das frações protéicas, no teor dos aminoácidos solúveis totais e aminoácidos incorporados em proteína em consequencia das alterações das enzimas envolvidas na síntese e degradação da lisina. Os resultados obtidos sugerem que a expressão da proteína heteróloga zeolina, que tem a necessidade de incorporação de lisina em sua estrutura, pode ter alterado a via metabólica do ácido aspártico para suprir a nova demanda de lisina. Essas alterações podem incluir o aumento na atividade da enzima AK, que é a primeira enzima da via que leva a síntese deste aminoácido e também uma redução na atividade da enzima de degradação LOR, pois o excesso de lisina livre que seria degradada é incorporado à nova proteína. / Lysine is an essential amino acid and one of the limiting factors for the use in cereals such as corn feed therefore, without supplementation; it does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made based on the results about routes of metabolism of lysine in plants and accumulation of storage proteins in endosperm. Ambrozevicius (2010) with the objective of producing transgenic corn plants with high content of lysine used a strategy of expression of storage proteins from other plant species which are rich in lysine, it means, through the expression of a heterologous protein: zeolin. This work aimed to study the 6 events processed expressing zeolina in F3 generation, featuring the storage proteins, the profile of amino acids and enzymes involved in the metabolism of lysine in genetically modified corn, in order to understand the possible biochemical changes which may have been generated by the transformation, and that may have led to the increase of essential amino acids in transgenic material The storage protein profile of transformed events exhibited reduction in the proportion of zein II and glutelins compared to control HiII, and yet very discrete increments of globulin, but not for all events processed. In the composition of soluble amino acids, it was observed increments in concentration of amino acids forming part of the metabolic pathway of aspartic acid: Lysine, methionine, threonine and isoleucine. For the amino acids incorporated into proteins, it was observed increments in the levels of lysine in the transformed events of globulin and glutelin fraction, both in relation to the control HiII. On the other hand, zein fraction I had the highest total amino acid content in all transformed events. The analysis of the enzymes involved in the metabolism of lysine revealed that changes occurred in two enzymes, the first enzyme involved in the synthesis of lysine, aspartate kinase (AK) and the second involved in the degradation of lysine, lysine ketoglutarate reductase (LOR). Although other enzymes involved in the synthesis and degradation of lysine have also been changed, the results were variable for different events. This work showed that the expression of heterologous protein zeolina caused changes in the composition of protein fractions, in the content of soluble amino acids and amino acids incorporated in consequence of changes in enzymes involved in the synthesis and degradation of lysine. The results suggest that the expression of heterologous protein zeolina, which has the need for incorporation of lysine in its structure, may have changed the aspartic acid pathway to meet the new demand for lysine. These changes may include the increase in AK enzyme activity, which is the first enzyme of the pathway leading to the synthesis of this amino acid and also a reduction in the activity of the enzyme degradation LOR, since the excess free lysine would be degraded is incorporated into the new protein.

A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação, pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido realizadas baseadas em resultados obtidos sobre as rotas de metabolismo da lisina em plantas e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma. Ambrozevicius (2010) com o objetivo de produzir plantas de milho transgênicas com alto teor de lisina utilizou a estratégia de expressão de proteínas de reserva de outras espécies vegetais ricas em lisina, ou seja, através da expressão de uma proteína heteróloga: a zeolina. O presente trabalho teve como objetivo estudar os 6 eventos transformados expressando a zeolina na geração F3, caracterizando as proteínas de reserva, o perfil de aminoácidos e as enzimas envolvidas no metabolismo de lisina em milho geneticamente modificado, para compreender quais as possíveis alterações bioquímicas podem ter sido geradas pela transformação, e que podem ter levado ao incremento dos aminoácidos essenciais neste material transgênico. O perfil de proteínas de reserva dos eventos transformados exibiu redução na proporção das zeínas II e glutelinas em relação ao controle HiII, e ainda aumentos muito discretos da fração globulina, porém não para todos os eventos transformados. Na composição de aminoácidos solúveis totais foram observados incrementos nos teores dos aminoácidos que fazem parte da via metabólica do ácido aspártico: lisina, metionina, treonina e isoleucina. Para os aminoácidos incorporados em proteínas, foram observados incrementos nos teores de lisina nos eventos transformados da fração globulina e da fração glutelina, ambos em relação ao controle HiII. Já a fração zeína I teve o maior conteúdo total de aminoácidos em todos os eventos transformados. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações em duas enzimas, a primeira enzima envolvida na síntese de lisina, aspartato quinase (AK) e a segunda envolvida na degradação de lisina, lisina cetoglutarato redutase (LOR). Embora as outras enzimas envolvidas na síntese e na degradação de lisina também tenham sido alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Este trabalho mostrou que a expressão da proteína heteróloga zeolina causou alterações na composição das frações protéicas, no teor dos aminoácidos solúveis totais e aminoácidos incorporados em proteína em consequencia das alterações das enzimas envolvidas na síntese e degradação da lisina. Os resultados obtidos sugerem que a expressão da proteína heteróloga zeolina, que tem a necessidade de incorporação de lisina em sua estrutura, pode ter alterado a via metabólica do ácido aspártico para suprir a nova demanda de lisina. Essas alterações podem incluir o aumento na atividade da enzima AK, que é a primeira enzima da via que leva a síntese deste aminoácido e também uma redução na atividade da enzima de degradação LOR, pois o excesso de lisina livre que seria degradada é incorporado à nova proteína. / Lysine is an essential amino acid and one of the limiting factors for the use in cereals such as corn feed therefore, without supplementation; it does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made based on the results about routes of metabolism of lysine in plants and accumulation of storage proteins in endosperm. Ambrozevicius (2010) with the objective of producing transgenic corn plants with high content of lysine used a strategy of expression of storage proteins from other plant species which are rich in lysine, it means, through the expression of a heterologous protein: zeolin. This work aimed to study the 6 events processed expressing zeolina in F3 generation, featuring the storage proteins, the profile of amino acids and enzymes involved in the metabolism of lysine in genetically modified corn, in order to understand the possible biochemical changes which may have been generated by the transformation, and that may have led to the increase of essential amino acids in transgenic material The storage protein profile of transformed events exhibited reduction in the proportion of zein II and glutelins compared to control HiII, and yet very discrete increments of globulin, but not for all events processed. In the composition of soluble amino acids, it was observed increments in concentration of amino acids forming part of the metabolic pathway of aspartic acid: Lysine, methionine, threonine and isoleucine. For the amino acids incorporated into proteins, it was observed increments in the levels of lysine in the transformed events of globulin and glutelin fraction, both in relation to the control HiII. On the other hand, zein fraction I had the highest total amino acid content in all transformed events. The analysis of the enzymes involved in the metabolism of lysine revealed that changes occurred in two enzymes, the first enzyme involved in the synthesis of lysine, aspartate kinase (AK) and the second involved in the degradation of lysine, lysine ketoglutarate reductase (LOR). Although other enzymes involved in the synthesis and degradation of lysine have also been changed, the results were variable for different events. This work showed that the expression of heterologous protein zeolina caused changes in the composition of protein fractions, in the content of soluble amino acids and amino acids incorporated in consequence of changes in enzymes involved in the synthesis and degradation of lysine. The results suggest that the expression of heterologous protein zeolina, which has the need for incorporation of lysine in its structure, may have changed the aspartic acid pathway to meet the new demand for lysine. These changes may include the increase in AK enzyme activity, which is the first enzyme of the pathway leading to the synthesis of this amino acid and also a reduction in the activity of the enzyme degradation LOR, since the excess free lysine would be degraded is incorporated into the new protein.

A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido feitas utilizando o melhoramento genético. Com o advento das técnicas de engenharia genética é possível, atualmente, utilizar a biotecnologia para aprofundar estes estudos, a fim de desvendar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos nos grãos. O presente trabalho tem como objetivo principal testar uma nova estratégia que se baseia na expressão de uma proteína quimérica, a zeolina, sob controle de um promotor endosperma específico. A zeolina é uma combinação de 421 aminoácidos da faseolina do feijão com 89 aminoácidos da y- zeína, inserida no genoma do milho sob controle de um promotor isolado da -kafirina de sorgo. Para que o objetivo do projeto fosse alcançado, o trabalho foi dividido nas seguintes etapas: i) Síntese da construção e clonagem nos vetores; ii) Transformação de embriões e calos de milho utilizando biobalística e Agrobacterium tumefaciens; iii) Cultura de tecidos para seleção e regeneração das plantas transformadas; iv) Verificação dos eventos de transformação através da análise do DNA, RNA e da proteína do transgene; v) Análises preliminares das plantas transformadas para o padrão das proteínas de reserva e perfil de aminoácidos dos grãos. A construção da zeolina foi amplificada por PCR com primers específicos e clonada nos vetores pCambia3301 e pTF102 sob controle do promotor da -kafirina. Os embriões e calos do milho híbrido HiII foram utilizados na transformação empregando-se a biobalística e Agrobacterium tumefaciens. No final do processo foram produzidas e multiplicadas oito plantas de milho transformadas com a zeolina, confirmadas por testes biológicos, PCR, sequenciamento e testes imunocromatográficos, representando seis eventos de transformação. A expressão gênica, verificada pela detecção do mRNA por PCR, foi constatada em seis eventos de transformação. Para detecção da proteína expressa pelo transgene foi utilizado anticorpo específico para faseolina, através do Western Blot. A banda relativa ao transgene foi detectada em três eventos de transformação. Nas análises preliminares não houve alteração no padrão das frações zeína, globulina, glutelina ou albumina nas plantas transformadas quando comparados com os controles. Também não houve diferenças significantes no teor de aminoácidos solúveis totais entre as plantas transformadas e os controles. Na determinação do perfil de aminoácidos no HPLC, o evento ZEO-3(3) apresentou as maiores concentrações para todos os aminoácidos analisados. Neste evento de transformação o teor de lisina foi de 25,76 mg/g de proteína, enquanto os controles apresentaram valores de 9,77 e 15,89mg/g de proteína. O evento ZEO-3(3) apresenta-se, portanto, como um candidato para estudos posteriores a fim de revelar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos e o acúmulo das proteínas de reserva nos grãos de milho. / Lysine is an essential amino acid and a major factor limiting the use of cereals such as maize for food and feed as, without supplementation, does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made using the conventional breeding. With the advent of genetic engineering techniques it is now possible to use biotechnology to develop further studies and to unravel the complex mechanisms that control the flow of amino acids in grains. The present work aimed at testing a new strategy based on the expression of a chimeric protein, the zeolin, under the control of an endosperm specific promoter. The zeolin is a combination of 421 amino acids of bean phaseolin with 89 amino acids of the maize - zein inserted into the maize genome under the control of a promoter isolated from the protein -kafirin from sorghum. For the goal of the project to be reached, the work was divided into the following steps: i) Synthesis of the construction and the cloning vectors; ii) Transformation of embryos and callus of maize using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens methods; iii) Tissue culture for selection and regeneration of transformed plants iv) Verification of transformation events through the analysis of the DNA, RNA and protein from the transgene; v) Preliminary analysis of transformed plants for the storage proteins pattern and amino acid profile of the grains. The zeolin construction was amplified by PCR with specific primers and cloned into the vectors pCambia3301 and pTF102 under the control of the promoter -kafirin. Embryos and callus of HiII hybrid were used in the transformation using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens. At the end of the process of transformatio, eight maize plants transformed with zeolin were produced and multiplied, confirmed by biological tests, PCR, sequencing and immunochromatographic tests, representing six transformation events. The gene expression, verified by detection of mRNA by PCR, was found in six events of transformation. The protein translation, verified by Western Blot using an antibody specific for phaseolin, was found in three transformation events. In the preliminary analysis, the pattern of zein, globulin, glutelin or albumin fractions did not change comparing transformed plants with the controls. There were also no significant differences in the content of soluble amino acids among the Western positive transformed plants and the controls. In the HPLC amino acid profile, the event ZEO-3(3) showed the higher concentrations for all amino acids analyzed. In this transformation event the content of lysine was 25,76mg/g protein, while the controls exhibited values of 9,77 and 15,89mg/g protein. Therefore, ZEO-3(3) event presents itself as a candidate for further studies to reveal the complex mechanisms that control the flow of amino acids and accumulation of storage proteins in maize kernels.

A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido feitas utilizando o melhoramento genético. Com o advento das técnicas de engenharia genética é possível, atualmente, utilizar a biotecnologia para aprofundar estes estudos, a fim de desvendar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos nos grãos. O presente trabalho tem como objetivo principal testar uma nova estratégia que se baseia na expressão de uma proteína quimérica, a zeolina, sob controle de um promotor endosperma específico. A zeolina é uma combinação de 421 aminoácidos da faseolina do feijão com 89 aminoácidos da y- zeína, inserida no genoma do milho sob controle de um promotor isolado da -kafirina de sorgo. Para que o objetivo do projeto fosse alcançado, o trabalho foi dividido nas seguintes etapas: i) Síntese da construção e clonagem nos vetores; ii) Transformação de embriões e calos de milho utilizando biobalística e Agrobacterium tumefaciens; iii) Cultura de tecidos para seleção e regeneração das plantas transformadas; iv) Verificação dos eventos de transformação através da análise do DNA, RNA e da proteína do transgene; v) Análises preliminares das plantas transformadas para o padrão das proteínas de reserva e perfil de aminoácidos dos grãos. A construção da zeolina foi amplificada por PCR com primers específicos e clonada nos vetores pCambia3301 e pTF102 sob controle do promotor da -kafirina. Os embriões e calos do milho híbrido HiII foram utilizados na transformação empregando-se a biobalística e Agrobacterium tumefaciens. No final do processo foram produzidas e multiplicadas oito plantas de milho transformadas com a zeolina, confirmadas por testes biológicos, PCR, sequenciamento e testes imunocromatográficos, representando seis eventos de transformação. A expressão gênica, verificada pela detecção do mRNA por PCR, foi constatada em seis eventos de transformação. Para detecção da proteína expressa pelo transgene foi utilizado anticorpo específico para faseolina, através do Western Blot. A banda relativa ao transgene foi detectada em três eventos de transformação. Nas análises preliminares não houve alteração no padrão das frações zeína, globulina, glutelina ou albumina nas plantas transformadas quando comparados com os controles. Também não houve diferenças significantes no teor de aminoácidos solúveis totais entre as plantas transformadas e os controles. Na determinação do perfil de aminoácidos no HPLC, o evento ZEO-3(3) apresentou as maiores concentrações para todos os aminoácidos analisados. Neste evento de transformação o teor de lisina foi de 25,76 mg/g de proteína, enquanto os controles apresentaram valores de 9,77 e 15,89mg/g de proteína. O evento ZEO-3(3) apresenta-se, portanto, como um candidato para estudos posteriores a fim de revelar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos e o acúmulo das proteínas de reserva nos grãos de milho. / Lysine is an essential amino acid and a major factor limiting the use of cereals such as maize for food and feed as, without supplementation, does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made using the conventional breeding. With the advent of genetic engineering techniques it is now possible to use biotechnology to develop further studies and to unravel the complex mechanisms that control the flow of amino acids in grains. The present work aimed at testing a new strategy based on the expression of a chimeric protein, the zeolin, under the control of an endosperm specific promoter. The zeolin is a combination of 421 amino acids of bean phaseolin with 89 amino acids of the maize - zein inserted into the maize genome under the control of a promoter isolated from the protein -kafirin from sorghum. For the goal of the project to be reached, the work was divided into the following steps: i) Synthesis of the construction and the cloning vectors; ii) Transformation of embryos and callus of maize using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens methods; iii) Tissue culture for selection and regeneration of transformed plants iv) Verification of transformation events through the analysis of the DNA, RNA and protein from the transgene; v) Preliminary analysis of transformed plants for the storage proteins pattern and amino acid profile of the grains. The zeolin construction was amplified by PCR with specific primers and cloned into the vectors pCambia3301 and pTF102 under the control of the promoter -kafirin. Embryos and callus of HiII hybrid were used in the transformation using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens. At the end of the process of transformatio, eight maize plants transformed with zeolin were produced and multiplied, confirmed by biological tests, PCR, sequencing and immunochromatographic tests, representing six transformation events. The gene expression, verified by detection of mRNA by PCR, was found in six events of transformation. The protein translation, verified by Western Blot using an antibody specific for phaseolin, was found in three transformation events. In the preliminary analysis, the pattern of zein, globulin, glutelin or albumin fractions did not change comparing transformed plants with the controls. There were also no significant differences in the content of soluble amino acids among the Western positive transformed plants and the controls. In the HPLC amino acid profile, the event ZEO-3(3) showed the higher concentrations for all amino acids analyzed. In this transformation event the content of lysine was 25,76mg/g protein, while the controls exhibited values of 9,77 and 15,89mg/g protein. Therefore, ZEO-3(3) event presents itself as a candidate for further studies to reveal the complex mechanisms that control the flow of amino acids and accumulation of storage proteins in maize kernels.