Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden. / Metabonomics forms the end of the omics-cascade and represents a top-down strategy for the interpretation of the metabolome, i. e. all the low molecular weight metabolites in an intact organism. The aim of the approach is to analyse characteristic metabolite profiles by suitable untargeted screening methods in biological samples like urine or blood that can be obtained in a non-invasive manner. In the context of metabonomics, the term “metabotype” was defined according to the geno- and phenotype, respectively. Biostatistical methods based on pattern recognition techniques allow comparing metabolic signatures and extracting group specific metabolites and biomarkers. Therefore, metabonomics can be regarded as the fusion of bioanalytical and biostatistical techniques. Since its introduction in 1999, the concept of metabonomics has permanently gained importance in many fields of scientific research. One aim was to transfer the methodology, which was originally established to predict toxic effects in drug development processes, to human issues. Apart from preclinical questions, metabonomics is increasingly applied in the area of personalised medicine and nutrition. As the NMR technique used by pioneers of the field was too insensitive and the resulting metabolite profiles were too susceptible to biological and analytical confounders, more sensitive techniques like mass spectrometry were more and more applied. Especially mass spectrometry in combination with high performance liquid chromatography showed great promise for the screening of metabolites. However, after a very short time, it was clear that the data sets resulting from full scan/TOF-methods were too complex to “separate the wheat from the chaff” with chemometric procedures. Metabolite databases are still under construction, and therefore marker identification is challenging and requires complex analytical techniques. Thus, one strategy is to concentrate on a certain metabolite subset. The focus on a metabolite class with a close relation to the mechanism under investigation can considerably increase the prospects of success in the biomarker identification process. Due to a variety of exogenous and endogenous factors (drugs, industrial chemicals, food ingredients, and tobacco smoke) the human organism is steadily confronted with a multitude of electrophilic compounds. Oxidative damage of the DNA, proteins, and lipids is associated with the development of diseases like Parkinson’s, Alzheimer’s, cancer and widespread diseases like arteriosclerosis, allergies and coronary heart diseases. With the glutathione system the human organism is equipped with an efficient detoxification mechanism. The tripeptide glutathione reacts as nucleophile with exogenously and endogenously formed electrophilic intermediates. End products are mercapturic acids (N-acetyl-L-cysteine-adducts) and respective sulfoxides that are predominantly excreted with urine. Therefore, there is a close relationship between these mercapturic acid patterns and the electrophilic burden of an organism. In this context, the aim of this thesis was to develop a non-invasive human metabonomics approach that focuses the metabolite screening on the effect, dose and susceptibility marker class of the mercapturic acids. Thus, the prospects of success regarding the identification of potential biomarkers for various toxicological and pathological endpoints should be increased.

Background: The appetite-stimulating hormone ghrelin is a fundamental regulator of human energy metabolism. A series of studies support the notion that long-term appetite and weight regulation may be already programmed in early life and it could be demonstrated that the intrauterine environment affects the ghrelin system of the offspring. Animal studies have also shown that intrauterine programming of orexigenic systems persists even until adolescence/adulthood. Methods: We hypothesized that plasma ghrelin concentrations in adulthood may be associated with the intrauterine exposure to cigarette smoke. We examined this hypothesis in a sample of 19-year-olds followed up since birth in the framework of the Mannheim Study of Children at Risk, an ongoing epidemiological cohort study of the long-term outcome of early risk factors. Results: As a main finding, we found that ghrelin plasma concentrations in young adults who had been exposed to cigarette smoke in utero were significantly higher than in those without prenatal smoke exposure. Moreover, individuals with intrauterine nicotine exposure showed a significantly higher prevalence of own smoking habits and lower educational status compared to those in the group without exposure. Conclusion: Smoking during pregnancy may be considered as an adverse intrauterine influence that may alter the endocrine-metabolic status of the offspring even until early adulthood.

Kardiovaskuläre Erkrankungen bilden weltweit die häufigste Todesursache. Neben vielfach untersuchten verhaltensabhängigen und verhaltensunabhängigen Risikofaktoren gilt insbesondere das ‚Rauchen‘ als maßgeblicher, beeinflussbarer Risikofaktor. Rauchen fördert die Entwicklung von atherosklerotischen Gefäßläsionen und Plaques im Sinne einer Atherosklerose sowie die damit assoziierte Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion und Induktion von proinflammatorischen Prozessen. Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden an humanen Gefäßbiopsien der A. thoracica interna die Wirkungen von Zigarettenrauch auf die arterielle Gefäßfunktion sowie molekularbiologische und histologische Parameter untersucht. Des Weiteren wurden mithilfe von ex vivo Stimulationsversuchen die pathologischen Wirkungen von konventionellen Zigaretten mit den Wirkungen des Heat-not-Burn Tabakprodukts (HnB-TP) IQOS verglichen. Die Forschungshypothesen lauten, dass Raucher (R) im Vergleich zu Nichtrauchern (NR) eine eingeschränkte Gefäßfunktion, eine erhöhte Expression von antioxidativen Stoffwechselwegen sowie proinflammatorischen Signalmolekülen und vermehrte atherosklerotische Gefäßveränderungen aufweisen. Bei der Gegenüberstellung des alternativen Heat-not Burn Tabakproduktes mit konventionellen Zigaretten wurde eine verminderte, jedoch weiterhin nachweisbare pathogene Wirkung von alternativen Produkten auf die Gefäßfunktion und Genexpression erwartet. Die Untersuchung der arteriellen Gefäßfunktion von Segmenten der A. thoracica interna männlicher KHK-Patienten im Alter zwischen 60 und 75 Jahren am Mulvany-Myograph beinhaltete die Bestimmung der Kalium- und Noradrenalin-abhängigen Kontraktionsfähigkeit, sowie die Untersuchung der Acetylcholin- und Natrium-Nitroprussid-abhängigen Relaxationsfähigkeit. Für den Vergleich des Einflusses von konventionellen Zigaretten und dem alternativen Tabakprodukt IQOS erfolgte, der Gefäßfunktionsmessung vorangehend, die Lagerung der Gefäßsegmente in wässrigen Rauchextrakten (AqE) der Referenzzigarette 3R4F und dem AqE des HnB-TP IQOS für 90 Minuten in nikotinäquivalenten Konzentrationen. Zur Untersuchung der mRNA-Expression von ausgewählten Zielgenen wurden qPCR Analysen des Arteriengewebes durchgeführt. Der Einfluss von Rauchen auf die Gefäßstruktur der A. thoracica interna wurde histologisch untersucht und CD 45+ Färbungen zur Untersuchung der Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel angefertigt. In der Analyse der Patientendaten hatten R im Vergleich zu NR zum Zeitpunkt der Bypass OP ein signifikant jüngeres Alter. Aufgrund der multifaktoriellen Genese der koronaren Herzerkrankung (KHK) zeigten verschiedenen Kohorten eine Erhöhung des HbA1c-Wertes, sowie eine altersbedingte Reduktion den glomerulären Filtrationsrate (GFR). Der Einfluss des Zigarettenkonsums auf arterielle Gefäße konnte durch eine eingeschränkte Kontraktionsfähigkeit der A. thoracica interna sowie eine eingeschränkte endothel-unabhängige Relaxationskapazität der Gefäßproben von R bestätigt werden. Der Vergleich der ACh-induzierten, endothelabhängigen Relaxation zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen R und NR. Als Ursachen der eingeschränkten Kontraktions- und endothelunabhängigen Relaxationsfähigkeit bei R wurden zytotoxische Effekte von Komponenten des Zigarettenrauchs auf die glatten Muskelzellen der Gefäßwand, eine Degradation des dilatativ wirkenden NO durch einen Anstieg der Radikalkonzentration im Gewebe, sowie eine Beeinträchtigung der Adrenozeptor Expression und Funktion diskutiert. Die mRNA-Expression des α1b Adrenozeptors war bei R im Vergleich zu NR signifikant reduziert. Einen Hinweis auf die Induktion von inflammatorischen Prozessen durch das Rauchen bietet eine signifikant erhöhte ICAM 1 mRNA-Expression bei R. Direkte Effekte des Zigarettenkonsums auf die Funktion und die mikroskopische Struktur des Endothels der A. thoracica interna wurden hingegen nicht beobachtet. In den Stimulationsversuchen mit dem AqE der Referenzzigarette 3R4F konnten die Ergebnisse der Raucherkohorte bei den nicht-stimulierten Versuchen repliziert und damit die Methodik der AqE-Stimulationen validiert werden. Dementsprechend zeigte sich nach der 3R4F-Stimulation eine reduzierte arterielle Kontraktionsfähigkeit und eine signifikant reduzierte endothelunabhängige Maximalrelaxation. Eine vermehrte Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-1ß und IFN-γ weist auf die Induktion von inflammatorischen Prozessen durch 3R4F hin. Im Vergleich zur Stimulation mit der Referenzzigarette konnte bei der Stimulation mit dem AqE des HnB TP IQOS keine relevante Veränderung der Gefäßfunktion in der A. thoracica interna beobachtet werden. Hinweisend auf eine Beeinflussung des Gefäßsystems auch durch alternative Tabakprodukte ist eine signifikant erhöhte IL-1ß Freisetzung nach der Stimulation mit IQOS. Zusammenfassend können die Ergebnisse dieser Arbeit die pathologischen Auswirkungen von Rauchen auf einige Aspekte des arteriellen Gefäßsystems aufzeigen und das methodische Vorgehen zur experimentellen Untersuchung von Wirkungen des Rauchens unter der Verwendung von flüssigen Rauchextrakten verifizieren. Die Ergebnisse der Stimulationsversuche bilden zudem einen Beitrag zur Einordnung der kardiovaskulären Beeinträchtigungen von alternativen Tabakprodukten. Im Vergleich zwischen dem konventionellen und dem alternativen HnB-TP IQOS wird ein verringerter pathologischer Einfluss des neuartigen Tabakproduktes auf die Gefäßfunktion sowie molekularbiologische Parameter deutlich. Dennoch kommt anhand der Studienergebnisse eine Aktivierung von proinflammatorischen Prozessen auch durch HnB-TP in Frage. Um in Zukunft eine umfassende Einschätzung zu den gesundheitlichen Einflüssen von HnB TP geben zu können, sind jedoch weitere Studien zur Untersuchung aller beeinträchtigten Organsysteme und insbesondere die Analyse von langzeitigen Auswirkungen der neuartigen Tabakprodukte unumgänglich.:I. Abbildungsverzeichnis I II. Tabellenverzeichnis III III. Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Gefäßaufbau 1 1.2 Arteria thoracica interna und aortokoronarer Bypass 2 1.3 Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion 3 1.4 Risikofaktoren der Atherosklerose 11 1.5 Der kardiovaskuläre Risikofaktor ‚Rauchen‘ 13 1.5.1 Zusammensetzung von Zigarettenrauch 13 1.5.2 Biologische Wirkungen des Zigarettenrauches im Gefäßsystem 14 1.5.3 Einfluss von Rauchen auf die Gefäßfunktion 16 1.5.4 Alternative Tabakprodukte 17 2 Zielsetzung und Hypothesen 21 3 Material und Methoden 22 3.1 Materialien und Chemikalien 22 3.1.1 Kitsysteme 22 3.1.2 Enzyme und Inhibitoren 23 3.1.3 Geräte 24 3.1.4 Zusammensetzung der Lösungen und Puffer 25 3.1.5 Wässriger Rauchextrakt 27 3.2 Studienkohorten 29 3.3 Transport und Präparation der Arteria thoracica interna 30 3.4 Gefäßfunktionsmessung 31 3.4.1 Chemikalien und Pufferlösungen 31 3.4.2 Stimulation der Gefäßringe mittels wässriger Rauchextrakte 32 3.4.3 Aufbau der Messkammer am Mulvany-Myograph 32 3.4.4 Protokoll der Gefäßfunktionsmessung 33 3.4.5 Auswertung der Gefäßfunktionsdaten 37 3.5 Molekularbiologische Analysen 38 3.5.1 Genexpressionsanalyse 38 3.5.2 Multiplex Cytokine Assay 42 3.6 Histologie 42 3.6.1 Vorbereitung der Proben 42 3.6.2 Elastika – van Gieson Färbung und Intima-Thickness Index 43 3.6.3 Immunhistochemische CD45+-Färbung 45 3.7 Funktionelle Assays 48 3.7.1 Amplex® Red Hydrogen Peroxide Assay 48 3.7.2 NO-Messung 49 3.8 Statistik 50 4 Ergebnisse 51 4.1 Vergleich zwischen Rauchern und Nichtrauchern 51 4.1.1 Gefäßfunktionsmessung 51 4.1.2 Molekularbiologische Analysen bei Nichtrauchern, Rauchern und Exrauchern 59 4.1.3 Histologische Analysen 69 4.2 Stimulation mittels AqE 74 4.2.1 Beschreibung der Studienkohorten 74 4.2.2 Ergebnisse der Gefäßfunktionsmessung nach Stimulation mit 3R4F und IQOS 76 4.2.3 Genexpression nach Stimulation 94 4.2.4 Zytokinfreisetzung nach Stimulation 97 4.2.5 Funktionelle Assays 100 5 Diskussion 102 5.1 Einfluss von Zigarettenkonsum auf A. thoracica interna 102 5.1.1 Studiengruppen-spezifische Unterschiede zwischen Nichtrauchern, Rauchern und Exrauchern 102 5.1.2 Einfluss von Rauchen auf die ex vivo Gefäßfunktion 103 5.1.3 Einfluss von Rauchen auf die Genexpression und die leukozytäre Adhäsion 108 5.1.4 Einfluss von Rauchen auf die Tunica Intima 110 5.2 Ergebnisse der Stimulation mit wässrigen Rauchextrakten 112 5.2.1 Wirkungen von 3R4F und IQOS auf die Gefäßkontraktilität und die mRNA-Expression 112 5.2.2 Wirkungen von 3R4F und IQOS auf die Gefäßrelaxation 115 5.2.3 Vergleich der Nikotinäquivalenzkonzentrationen zwischen 3R4F und IQOS 116 6 Limitationen 119 7 Zusammenfassung 121 8 Summary 123 9 Literaturverzeichnis 125 Anhang i Publikationen und Abstracts v Danksagung vi