A homeostase da mama normal depende das interações entre células epiteliais e o estroma a elas associado. Estudos anteriores mostraram que no carcinoma mamário o estroma é constituído por células com diferentes funções. Estes elementos do estroma incluem fibroblastos, os quais modulam o comportamento tumoral, fornecendo fatores de crescimento e componentes de matriz extracelular. Nosso objetivo foi investigar a expressão gênica diferencial entre fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico ou não neoplásico e analisar a influência de células epiteliais normais (MCF10A) no perfil de expressão gênica de fibroblastos obtidos de tecido mamário neoplásico. Culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas e a expressão de vimentina e actina de músculo liso foi positiva. Foi realizada a co-cultura destas células com separação por insertos, o que permite a passagem de fatores solúveis, e o RNA foi extraído. Após a amplificação do RNAm foram sintetizadas sondas de cDNA, as quais foram marcadas com fluorocromos conjugados a deoxinucleotídeo, hibridizadas competitivamente sobre lâminas de vidro contendo 4.608 ORESTES criadas no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP e os sinais fluorescente gerados foram quantificados. Após a normalização destes dados, os genes diferencialmente expressos, com False Discovery Ratio (FDR) menor que 0,05, foram selecionados para análises posteriores. Encontramos 283 genes diferencialmente expressos em fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico quando comparados àqueles derivados de tecido mamário não-neoplásico. Dentre estes genes, 187 foram quantitativamente regulados negativamente (com variação de expressão de 1,05 a 4,14) contra 96 regulados positivamente (variação de expressão de 1,17 a 7,73). A maioria destas alterações foram relacionadas ao transporte entre membranas, transdução de sinal e biosíntese. Estes resultados podem sugerir uma redução na expressão gênica durante o processo de transformação. Após a co-cultura com células MCF10A, encontramos 566 genes diferencialmente expressos nos fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico, 323 foram regulados negativamente (expressão variando de 1,09 a 10,62) e 243 regulados positivamente (variação de expressão de 1,03 a 16,62). A influência das células MCF10A na expressão gênica destes fibroblastos pôde ser vista através da desregulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular, adesão, apoptose e sobrevivência. / The homeostasis of normal breast depends on interactions between epithelial cells and their associated stroma. Previous studies indicated that in breast cancer carcinoma, tumor associated stromal cells with different functions appear to be emerged. These stromal elements include fibroblasts which modulate tumor behavior providing various growth factors and extracellular matrix components. Our aim was to evaluate the differential gene expression between fibroblasts derived from mammary tissue neoplasic or not and to analyze the influence of normal epithelial cells (MCF10A) on gene expression profile of fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue. Fibroblast primary cultures were established and expression of vimentin and smooth cell actin was positive. Co-culture of these cell types separated by inserts, which allow the passage of soluble factors, was done and total RNA was extracted. After mRNA amplification using a template-switching prime, cDNA probes were synthesized, labeled with fluorochrome conjugated deoxynucleotide, a competitive hybridization was undertaken onto cDNA microarray glass slides in which 4,608 ORESTES (open reading frame expressed sequence tags) from Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP bank were spotted and fluorescent signals were quantified. After normalization, the differentially expressed genes, at a False Discovery Ratio (FDR) less then 0.05, were selected for further analysis. We found 283 differentially expressed genes in fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue when compared with non neoplasic derived fibroblasts. Among these genes, 187 were quantitatively down regulated (fold ranging from 1.05 to 4.14) against 96 up regulated (fold ranging from 1.17 to 7.73). The majority of alterations were related to membrane transport, signaling transduction and biosynthesis. Overall these results could suggest a reduced gene expression along transformation process After coculture with MCF10A cells, we found 566 differentially expressed genes in neoplasic mammary tissue derived fibroblasts, 323 were down regulated (fold ranging from 1.09 to 10.62) and 243 up regulated (fold ranging from 1.03 to 16.62). MCF10A influence in mammary tissue neoplasic derived fibroblasts gene expression could be seen trough the deregulation of expression of some genes possibly related cell proliferation, adhesion, apoptosis and survival.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20092010-185009 |
| Date | 05 April 2005 |
| Creators | Rozenchan, Patricia Bortman |
| Contributors | Brentani, Maria Mitzi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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