Orientador: Patrícia Pintor dos Reis / Resumo: Os anticorpos são proteínas altamente específicas, com síntese estimulada pela presença de um antígeno, que podem ser usados como ferramentas em pesquisa, diagnóstico clínico, acompanhamento de patologias, inferência in silico e terapêutica. Diferentes metodologias baseadas no uso de anticorpos vêm sendo descritas e, a grande maioria delas utilizando como ferramenta a construção por técnicas moleculares da fração de ligação ao antígeno (Fab) ou as frações variáveis da imunoglobulina. O estudo e aplicação dos anticorpos desenvolvidos in vitro na prática médica humana cresceu muito nos últimos anos, no entanto o mesmo não ocorreu no campo da medicina veterinária, área que carece de estudos nesse sentido. Assim, este estudo buscou realizar a criação de uma biblioteca de frações variáveis de anticorpos em hiperplasia e neoplasia mamária em cães e criar um banco de dados gerado por sequenciamento em larga escala de sequências destes anticorpos para disponibilização pública, contribuindo, assim, para futuras aplicações e avanços científicos no campo da medicina veterinária. / Abstract: Antibodies are highly specific proteins, with stimulated synthesis by the presence of an antigen, which can be used as tools in research, clinical diagnosis, pathology monitoring, in silico inference and therapeutics. Different methodologies based on the use of antibodies have been described and the majority of them uses molecular techniques to construct the antigen binding fraction (Fab) or the variable fractions of the immunoglobulin. Description and application of antibodies developed in vitro in the human medical practice has grown a lot in the last years, however the same has not occurred in veterinary medicine field. Thus, this study aimed to create a library of variable fractions of antibodies in mammary hyperplasia and neoplasia in dogs and to create a database generated by large-scale sequencing of these antibodies for public availability, thus contributing to future applications and scientific advances in veterinary medicine. / Doutor

O reconhecimento de subtipos de carcinomas mamários baseados em suas características moleculares trouxe novas perspectivas na investigação do câncer de mama. Algumas proteínas chaves reguladoras da angiogênese e da infiltração tumoral foram avaliadas em carcinomas de mama de fenótipo basal (CK5+). Foi realizado estudo Imunoistoquímico com 14 anticorpos primários em 100 casos de carcinoma ductal. A positividade para citoqueratina 5 correlacionou-se com indicadores de mau prognóstico, incluindo idade precoce, alto grau histológico, linfonodos positivos, estádio patológico avançado, negatividade para receptores hormonais, e uma alta taxa de proliferação celular, avaliado pelo Ki67. A positividade para a CK5 também se correlacionou com a expressão do VEGF, mas não com a densidade da microvascularização. Considerando que a superexpressão de VEGF pelas células neoplásicas da mama leva a um aumento da atividade proliferativa in vitro independente de seu efeito angiogênico, a expressão diferencial do VEFG pode contribuir para o comportamento mais agressivo da neoplasia. Houve correlação do CK5 com TIMP1, mas não com MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicando que o estimulo antiproteolítico pode ser preponderante nesta neoplasia. / The recognition of subtypes of breast carcinomas based on their molecular features has brought new perspectives in breast cancer investigation. Some key regulators of angiogenesis and tumor infiltration were evaluated in breast carcinomas of basal-phenotype (CK5+). Immunohistochemistry with 14 primary antibodies was performed in 100 formalin-fixed paraffin-embedded samples of invasive ductal carcinomas. Cytokeratin 5 correlated with indicators of poor outcome, including precocious age, high histological grade, lymph node positivity, advanced pathological stage, negativity for hormonal receptors, and a high proliferative rate (Ki67 labeled index). CK5 also correlated with VEGF expression but not with the microvessel density. Considering that VEGF overexpressing neoplastic mammary cells display increased proliferative activity in vitro regardless its angiogenic effect, the differential expression of VEGF may contribute for the more aggressive behavior of these neoplasms. CK5 correlated with TIMP1, but not MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicating that anti-proteolytic stimuli may be preponderant in these neoplasms.

O reconhecimento de subtipos de carcinomas mamários baseados em suas características moleculares trouxe novas perspectivas na investigação do câncer de mama. Algumas proteínas chaves reguladoras da angiogênese e da infiltração tumoral foram avaliadas em carcinomas de mama de fenótipo basal (CK5+). Foi realizado estudo Imunoistoquímico com 14 anticorpos primários em 100 casos de carcinoma ductal. A positividade para citoqueratina 5 correlacionou-se com indicadores de mau prognóstico, incluindo idade precoce, alto grau histológico, linfonodos positivos, estádio patológico avançado, negatividade para receptores hormonais, e uma alta taxa de proliferação celular, avaliado pelo Ki67. A positividade para a CK5 também se correlacionou com a expressão do VEGF, mas não com a densidade da microvascularização. Considerando que a superexpressão de VEGF pelas células neoplásicas da mama leva a um aumento da atividade proliferativa in vitro independente de seu efeito angiogênico, a expressão diferencial do VEFG pode contribuir para o comportamento mais agressivo da neoplasia. Houve correlação do CK5 com TIMP1, mas não com MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicando que o estimulo antiproteolítico pode ser preponderante nesta neoplasia. / The recognition of subtypes of breast carcinomas based on their molecular features has brought new perspectives in breast cancer investigation. Some key regulators of angiogenesis and tumor infiltration were evaluated in breast carcinomas of basal-phenotype (CK5+). Immunohistochemistry with 14 primary antibodies was performed in 100 formalin-fixed paraffin-embedded samples of invasive ductal carcinomas. Cytokeratin 5 correlated with indicators of poor outcome, including precocious age, high histological grade, lymph node positivity, advanced pathological stage, negativity for hormonal receptors, and a high proliferative rate (Ki67 labeled index). CK5 also correlated with VEGF expression but not with the microvessel density. Considering that VEGF overexpressing neoplastic mammary cells display increased proliferative activity in vitro regardless its angiogenic effect, the differential expression of VEGF may contribute for the more aggressive behavior of these neoplasms. CK5 correlated with TIMP1, but not MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicating that anti-proteolytic stimuli may be preponderant in these neoplasms.

A homeostase da mama normal depende das interações entre células epiteliais e o estroma a elas associado. Estudos anteriores mostraram que no carcinoma mamário o estroma é constituído por células com diferentes funções. Estes elementos do estroma incluem fibroblastos, os quais modulam o comportamento tumoral, fornecendo fatores de crescimento e componentes de matriz extracelular. Nosso objetivo foi investigar a expressão gênica diferencial entre fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico ou não neoplásico e analisar a influência de células epiteliais normais (MCF10A) no perfil de expressão gênica de fibroblastos obtidos de tecido mamário neoplásico. Culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas e a expressão de vimentina e actina de músculo liso foi positiva. Foi realizada a co-cultura destas células com separação por insertos, o que permite a passagem de fatores solúveis, e o RNA foi extraído. Após a amplificação do RNAm foram sintetizadas sondas de cDNA, as quais foram marcadas com fluorocromos conjugados a deoxinucleotídeo, hibridizadas competitivamente sobre lâminas de vidro contendo 4.608 ORESTES criadas no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP e os sinais fluorescente gerados foram quantificados. Após a normalização destes dados, os genes diferencialmente expressos, com False Discovery Ratio (FDR) menor que 0,05, foram selecionados para análises posteriores. Encontramos 283 genes diferencialmente expressos em fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico quando comparados àqueles derivados de tecido mamário não-neoplásico. Dentre estes genes, 187 foram quantitativamente regulados negativamente (com variação de expressão de 1,05 a 4,14) contra 96 regulados positivamente (variação de expressão de 1,17 a 7,73). A maioria destas alterações foram relacionadas ao transporte entre membranas, transdução de sinal e biosíntese. Estes resultados podem sugerir uma redução na expressão gênica durante o processo de transformação. Após a co-cultura com células MCF10A, encontramos 566 genes diferencialmente expressos nos fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico, 323 foram regulados negativamente (expressão variando de 1,09 a 10,62) e 243 regulados positivamente (variação de expressão de 1,03 a 16,62). A influência das células MCF10A na expressão gênica destes fibroblastos pôde ser vista através da desregulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular, adesão, apoptose e sobrevivência. / The homeostasis of normal breast depends on interactions between epithelial cells and their associated stroma. Previous studies indicated that in breast cancer carcinoma, tumor associated stromal cells with different functions appear to be emerged. These stromal elements include fibroblasts which modulate tumor behavior providing various growth factors and extracellular matrix components. Our aim was to evaluate the differential gene expression between fibroblasts derived from mammary tissue neoplasic or not and to analyze the influence of normal epithelial cells (MCF10A) on gene expression profile of fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue. Fibroblast primary cultures were established and expression of vimentin and smooth cell actin was positive. Co-culture of these cell types separated by inserts, which allow the passage of soluble factors, was done and total RNA was extracted. After mRNA amplification using a template-switching prime, cDNA probes were synthesized, labeled with fluorochrome conjugated deoxynucleotide, a competitive hybridization was undertaken onto cDNA microarray glass slides in which 4,608 ORESTES (open reading frame expressed sequence tags) from Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP bank were spotted and fluorescent signals were quantified. After normalization, the differentially expressed genes, at a False Discovery Ratio (FDR) less then 0.05, were selected for further analysis. We found 283 differentially expressed genes in fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue when compared with non neoplasic derived fibroblasts. Among these genes, 187 were quantitatively down regulated (fold ranging from 1.05 to 4.14) against 96 up regulated (fold ranging from 1.17 to 7.73). The majority of alterations were related to membrane transport, signaling transduction and biosynthesis. Overall these results could suggest a reduced gene expression along transformation process After coculture with MCF10A cells, we found 566 differentially expressed genes in neoplasic mammary tissue derived fibroblasts, 323 were down regulated (fold ranging from 1.09 to 10.62) and 243 up regulated (fold ranging from 1.03 to 16.62). MCF10A influence in mammary tissue neoplasic derived fibroblasts gene expression could be seen trough the deregulation of expression of some genes possibly related cell proliferation, adhesion, apoptosis and survival.

Orientador: Luis Fernando Barbisan / Resumo: O câncer de mama apresenta história natural diversa, histologia complexa e com incidência crescente nas últimas décadas. Atualmente, existem poucos tratamentos para o câncer de mama hormônio-dependente e as drogas comumente utilizadas estão intimamente associadas a graves efeitos colaterais que limitam sua utilização. A imunoterapia apresenta-se como uma vertente para o tratamento do câncer e cresce cada vez mais o número de pesquisas voltadas ao papel de receptores toll-like no processo de carcinogênese. O P-MAPA é considerado um imunomodulador e através de estudos experimentais e ensaios clínicos, este composto tem demonstrado exercer atividade antiviral e antitumoral, aumentando a expressão de citocinas, ativando linfócitos e receptores toll-like. Assim, os objetivos do presente estudo foram caracterizar e comparar os efeitos histopatológicos e moleculares da imunoterapia com P-MAPA associada ao Tamoxifeno no tratamento do câncer de mama induzido quimicamente em ratas Sprague-Dawley (SD). Para o desenvolvimento deste trabalho, fêmeas SD foram divididas em sete grupos experimentais: os grupos 1-4 receberam dose única do carcinógeno 7,12- dimetil-benzoantraceno (DMBA) (80 mg/kg, i.g) durante a primeira semana do experimento, enquanto os grupos 5-7 receberam dose única do veículo da DMBA. A seguir, grupos 2 e 5 receberam doses do P-MAPA (5,0 mg/kg, 3x/semana, i.p) e do veículo do Tamoxifeno (5x/semana). Os grupos 3 e 6 receberam doses do P-MAPA e do Tamoxifeno (100ug/kg, 5x/s... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A homeostase da mama normal depende das interações entre células epiteliais e o estroma a elas associado. Estudos anteriores mostraram que no carcinoma mamário o estroma é constituído por células com diferentes funções. Estes elementos do estroma incluem fibroblastos, os quais modulam o comportamento tumoral, fornecendo fatores de crescimento e componentes de matriz extracelular. Nosso objetivo foi investigar a expressão gênica diferencial entre fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico ou não neoplásico e analisar a influência de células epiteliais normais (MCF10A) no perfil de expressão gênica de fibroblastos obtidos de tecido mamário neoplásico. Culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas e a expressão de vimentina e actina de músculo liso foi positiva. Foi realizada a co-cultura destas células com separação por insertos, o que permite a passagem de fatores solúveis, e o RNA foi extraído. Após a amplificação do RNAm foram sintetizadas sondas de cDNA, as quais foram marcadas com fluorocromos conjugados a deoxinucleotídeo, hibridizadas competitivamente sobre lâminas de vidro contendo 4.608 ORESTES criadas no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP e os sinais fluorescente gerados foram quantificados. Após a normalização destes dados, os genes diferencialmente expressos, com False Discovery Ratio (FDR) menor que 0,05, foram selecionados para análises posteriores. Encontramos 283 genes diferencialmente expressos em fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico quando comparados àqueles derivados de tecido mamário não-neoplásico. Dentre estes genes, 187 foram quantitativamente regulados negativamente (com variação de expressão de 1,05 a 4,14) contra 96 regulados positivamente (variação de expressão de 1,17 a 7,73). A maioria destas alterações foram relacionadas ao transporte entre membranas, transdução de sinal e biosíntese. Estes resultados podem sugerir uma redução na expressão gênica durante o processo de transformação. Após a co-cultura com células MCF10A, encontramos 566 genes diferencialmente expressos nos fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico, 323 foram regulados negativamente (expressão variando de 1,09 a 10,62) e 243 regulados positivamente (variação de expressão de 1,03 a 16,62). A influência das células MCF10A na expressão gênica destes fibroblastos pôde ser vista através da desregulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular, adesão, apoptose e sobrevivência. / The homeostasis of normal breast depends on interactions between epithelial cells and their associated stroma. Previous studies indicated that in breast cancer carcinoma, tumor associated stromal cells with different functions appear to be emerged. These stromal elements include fibroblasts which modulate tumor behavior providing various growth factors and extracellular matrix components. Our aim was to evaluate the differential gene expression between fibroblasts derived from mammary tissue neoplasic or not and to analyze the influence of normal epithelial cells (MCF10A) on gene expression profile of fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue. Fibroblast primary cultures were established and expression of vimentin and smooth cell actin was positive. Co-culture of these cell types separated by inserts, which allow the passage of soluble factors, was done and total RNA was extracted. After mRNA amplification using a template-switching prime, cDNA probes were synthesized, labeled with fluorochrome conjugated deoxynucleotide, a competitive hybridization was undertaken onto cDNA microarray glass slides in which 4,608 ORESTES (open reading frame expressed sequence tags) from Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP bank were spotted and fluorescent signals were quantified. After normalization, the differentially expressed genes, at a False Discovery Ratio (FDR) less then 0.05, were selected for further analysis. We found 283 differentially expressed genes in fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue when compared with non neoplasic derived fibroblasts. Among these genes, 187 were quantitatively down regulated (fold ranging from 1.05 to 4.14) against 96 up regulated (fold ranging from 1.17 to 7.73). The majority of alterations were related to membrane transport, signaling transduction and biosynthesis. Overall these results could suggest a reduced gene expression along transformation process After coculture with MCF10A cells, we found 566 differentially expressed genes in neoplasic mammary tissue derived fibroblasts, 323 were down regulated (fold ranging from 1.09 to 10.62) and 243 up regulated (fold ranging from 1.03 to 16.62). MCF10A influence in mammary tissue neoplasic derived fibroblasts gene expression could be seen trough the deregulation of expression of some genes possibly related cell proliferation, adhesion, apoptosis and survival.

Orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Coorientador: Heitor Flávio Ferrari / Banca: Daniela Bernadete Rozza / Banca: Livia Castanhas Breganó / Resumo: O tumor mamário canino (TMC) é a neoplasia que mais comumente acomete cadelas idosas não castradas. Na análise histopatológica, 41 a 53% dos TMCs são classificados como malignos. Os receptores de estrógeno α (REα) são receptores nucleares importantes na transcrição de fatores e transdução de sinais hormonais, considerados um dos fatores prognósticos para o tumor mamário humano, participam de forma ativa na carcinogênese mamária. Durante o desenvolvimento do TMC, macrófagos teciduais compõe o microambiente tumoral, com a função de estimular a angiogênese, aumentando a possibilidade de metástases, sendo fundamental para o prognóstico de neoplasia mamária na cadelae na mulher. O objetivo deste trabalho foi pesquisara expressão e a provável correlação de REα com a distribuição de macrófagos tumorais (TAMs) em TMCs por meio de imunohistoquímica. Foram analisados 40 tumores mamários malignos, classificados histologicamente em quatro grupos distintos e um grupo controle composto por 08 glândulas mamárias caninas sem alteração anatomopatológica e seus respectivos linfonodos regionais. Os resultados mostraram que a imunomarcação positiva ao REα variou de um a três casos dentre os grupos histológicos estudados, havendo nestes, menor número de metástase para linfonodo. A positividade para os TAMs mostrou associação com o tipo histológico, variando de moderada a acentuada nos carcinomas mamários de alto grau histológico que apresentaram necrose, invasão linfática e formação tubular. Não ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The canine mammary tumor (CMT) is the neoplasia that most commonly affects uncastrated elderly female dogs. On histopathological analysis, 41 to 53% of CMTs are classified as malignant. Estrogen receptors α (REα) are important nuclear receptors for transcription factors and signal transduction of hormones, considered prognosis factor for breast cancer in human, and recognized as actively involved in breast carcinogenesis. During the development of mammary cancer in canine species, macrophages composes the tumor microenvironment, stimulating angiogenesis, facilitating the local dissemination of neoplastic cells and increasing the possibility of metastasis, being fundamental for mammary neoplasia prognosis in dogs and women. This study aimed to evaluate the expression and the probable correlation of REα with the distribution of tumor associated macrophages (TAMs) in CMTs by immunohistochemistry. Forty CMTs were analyzed histologically in four distinct groups and a control group composed of eight canine mammary glands without alteration anatomopathological and their respective regional lymph nodes. The results showed that the REα positive immunostaining varied from one to three cases among the histological groups studied, and there was less lymph node metastasis. The positivity for TAMs showed a positive correlation with the histological type, ranging from moderate to severe in mammary carcinomas of high histological grade that presented necrosis, lymphatic invasion and tubular ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre