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Previous issue date: 2010-04-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Objetivo: O objetivo principal deste estudo foi avaliar a presença de carbapenemases entre amostras de enterobactérias isoladas no Complexo Hospital São Paulo (UNIFESP) entre junho e julho de 2008. Métodos: A detecção dos genes codificadores de MBL e KPC foi realizada pela técnica de PCR. O teste de triagem foi realizado para detectar a presença de enterobactérias com sensibilidade reduzida aos carbapenens, as quais foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos pela técnica de ágar diluição. As amostras que confirmaram a sensibilidade reduzida a pelo menos um dos carbapenens foram submetidas ao teste de Hodge modificado, ao teste de hidrólise de β-lactâmicos e à pesquisa fenotípica e genotípica da produção de ESBL e AmpC plasmidial. A avaliação do perfil de proteínas de membrana externa foi realizada através da amplificação e seqüenciamento dos genes codificadores das porinas OmpK35 e OmpK36. A avaliação da relação genética entre as amostras com redução da sensibilidade aos carbapenens foi realizada pelo método de ribotipagem automatizada. A determinação dos grupos de incompatibilidade plasmidial foi realizada conforme descrito por Carattoli et al., 2005 e Götz et al., 1996, para 10% das amostras incluídas no estudo e para as amostras controles produtoras de MBL. Resultados: 450 amostras clínicas de enterobactérias foram estudadas. Os genes codificadores das carbapenemases do tipo MBL e KPC não foram detectados em nenhuma amostra. A taxa de sensibilidade ao meropenem, imipenem e ertapenem entre estas amostras foi de 99,3%, 98,4% e 98%, respectivamente. Os isolados com sensibilidade reduzida a pelo menos um dos carbapenens totalizaram 2,9% das amostras. Destes, somente 45,5%, (5 amostras de Klebsiella pneumoniae) confirmaram este fenótipo pela ágar diluição. O teste de Hodge e o teste de hidrólise não detectaram a produção de carbapenemases nestas amostras. Os mecanismos de resistência responsáveis pela redução de sensibilidade aos carbapenens nas amostras de K. pneumoniae foram a produção de ESBL (blaCTX-M, blaSHV e/ou blaTEM) associada a alteração nas proteínas de membrana externa (n=4), ou somente a alteração das proteínas de membrana externa (n=1). Destas amostras, três K. pneumoniae foram classificadas como pertencentes ao mesmo ribogrupo. A determinação dos grupos de incompatibilidade plasmidial foi realizada para verificar se as amostras não adquiriam os genes codificadores de MBL devido à incompatibilidade entre os plasmídeos carreadores de tais genes e os plasmídeos presentes nas amostras de enterobactérias. Não houve amplificação dos genes relacionados aos grupos de incompatibilidade plasmidial em 58,5% das amostras. Os grupos de incompatibilidade plasmidial encontrados nas demais amostras foram I1, FIA, FIB, FIC, FrepB, FIIs, P, K/B, N, L/M, A/C e Q. Somente para duas das sete amostras controles produtoras de MBL foi possível realizar a tipagem plasmidial, S. marcescens produtora de IMP-1 (IncQ) e E. cloacae produtor de IMP-1 (IncQ e IncA/C). Conclusões: Apesar da grande prevalência de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. produtores de MBL no Hospital São Paulo, a produção de carbapenemases por enterobactérias com diminuição da sensibilidade aos carbapenens não foi detectada. A sensibilidade reduzida aos carbapenens ocorre devido à associação de β-lactamases com alteração das proteínas da membrana externa. A hipótese da não transferência dos genes codificadores de MBL devido à incompatibilidade dos plasmídeos carreadores de tais genes e os plasmídeos naturalmente presentes nas enterobactérias não pode ser confirmada porque as amostras de enterobactérias apresentavam plasmídeos não tipavéis pelas técnicas utilizadas. / Objective: The aim of this study was to evaluate the presence of carbapenemases in Enterobacteriaceae isolated in Hospital São Paulo Complex (UNIFESP) between June and July 2008. Methods: The presence of MBL- and KPC-encoding genes was investigated by PCR. A screening test was conducted to detect isolates non-susceptible to at least one carbapenem. The antimicrobial susceptibility profile was determined by the CLSI agar dilution method for all isolates non-susceptible to carbapenens. Modified Hodge test and the detection of β-lactam hydrolysis, carried out by spectrophotometer assays, were conducted for the isolates that confirmed to be non-susceptible to at least one carbapenem. The production of ESBL or plasmid-mediated AmpC β-lactamases was investigated by phenotypic tests and their respective encoding genes were investigated by PCR. Amplifications of ompK35 and ompK36 genes were performed to evaluate whether outer membrane proteins (OMPs)-encoding genes were disrupted or missing. Clonality among isolates non-susceptible to carbapenens was assessed by automated ribotyping. The incompatibility groups of plasmids were determined by PCR-based replicon typing as previously described by Carattoli et al., 2005 and Götz et al., 1996, for 10% of the isolates included in this study and of 7 MBL-producing control strains. Results: 450 Enterobacteriaceae clinical isolates were investigated. The MBL and KPC-encoding genes were not detected in any isolate. The susceptibility rate to meropenem, imipenem and ertapenem were 99.3%, 98.4% and 98%, respectively. Overall, 2.9% of the isolates were classified as nonsusceptible to carbapenens. Of those, only 45.5% (5 K. pneumoniae isolates) confirmed to be non-susceptible to at least one carbapenem by the agar dilution technique. The modified Hodge test and the β-lactam hydrolysis by spectrophotometer assays did not detect carbapenemase production in these isolates. The mechanisms conferring reduced susceptibility to carbapenems among these isolates are the production of ESBL (blaCTX-M, blaSHV and/or blaTEM) associated with altered OMPs (n=4), or only altered OMPs (n=1). Three K. pneumoniae isolates non-susceptible to carbapenens were clustered in one ribogroup. The determination of plasmids’ incompatibility group was carried out to verify if transmission of MBL-encoding genes was prevented due to incompatibility between plasmids occurring in the Enterobacteriaceae clinical isolates studied and those carrying MBL-encoding genes. The incompatibility group of 58.5% of isolates could not be determined due to lack of amplification. Among the remaining isolates the incompatibility groups I1, FIA, FIB, FIC, FrepB, FIIs, P, K/B, N, L/M, A/C and Q were found. Among the MBL producers, the incompatibility group could be determined only for two IMP-1 producers, S. marcescens (IncQ) and E. cloacae (IncQ and IncA/C). Conclusions: While MBL-production is highly prevalent among P. aeruginosa and Acinetobacter spp. clinical isolates from Hospital São Paulo, Enterobacteriaceae isolates nonsusceptible to carbapenens due to carbapenemase production were not detected. In contrast, reduced susceptibility to carbapenems occurred due to the association of β-lactamase production with altered OMPs. The hypothesis that incompatibility between plasmids could have prevented transmission of MBL-encoding genes from non-fermenter rods to Enterobacteriaceae could not be confirmed since most strains presented non-typable plasmid content. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9034 |
| Date | 28 April 2010 |
| Creators | Nicoletti, Adriana Giannini [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Gales, Ana Cristina [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 142 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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