Les spectrines, protéines liant l'actine, sont des constituants majeurs du squelette membranaire, réseau multiprotéique localisé sous la membrane plasmique. Érythroïdes ou non érythroïdes (dans ce cas, on les appelle fodrines), les spectrines ont un rôle structural important dans la membrane comme cela a déjà été démontré, pour la spectrine, dans le globule rouge. Elles sont constituées de deux longues chaînes a et ß associées côte à côte en tétramères (aß)2 qui forment les longs filaments du réseau. Chacune des chaînes est composée par la répétition de segments homologues, 22 pour a et 17 pour ß. Ces segments sont constitués de trois hélices a (hélices A, B et C) repliées sur elles-mêmes. Cette succession de structures trihélicoïdales est parfois interrompue par un domaine particulier comme le domaine SH3 (Src Homology 3) présent au milieu de la chaîne a. Les tétramères (aß)2 de spectrine constituent les filaments du squelette membranaire. L'interaction tête-à-tête de deux dimères aß implique les extrémités NH2 de la chaîne a et COOH de la chaîne ß. D'une part la sévérité du défaut d'auto-association et la localisation des mutations associées à celui-ci et d'autre part, les séquences en acides aminés des extrémités impliquées dans le site d'auto-association ont permis de proposer un modèle : la première hélice C isolée de la chaîne a pourrait s'associer aux deux dernières hélices A et B de la chaîne ß pour reconstituer une unité conformationnelle trihélicoïdale semblable à celles observées le long de la molécule. Un défaut dans la formation du tétramère est le support moléculaire le plus fréquemment observé dans les elliptocytoses héréditaires (HE). À l'aide de peptides recombinants, nous avons défini, sur les deux chaînes, les régions nécessaires et suffisantes possédant les caractéristiques pleinement fonctionnelles du site de tétramérisation. Nous avons ensuite, par mutagenèse dirigée, reproduit le lien entre la présence de mutations HE localisées dans les hélices A ou B et le défaut d'auto-association observé dans les globules rouges de patients HE. La présence d'un domaine SH3 localisé au milieu de la chaîne a confère probablement aux spectrine des fonctions autres que le maintien et la stabilité de la membrane. Les SH3, petits domaines protéiques, participent aux interactions protéine/protéine. Le seul partenaire connu du domaine SH3 de la fodrine était la sous-unité a du canal sodium sensible à l'amiloride (ENaC) mais la fonction de ce complexe n'était pas encore caractérisée. À l'aide de différentes méthodes, nous avons remis en cause l'interaction directe entre ENaC et le SH3 de la fodrine. La fonction de ce domaine SH3 étant liée à la nature de son ligand, nous avons donc recherché les partenaires putatifs du domaine SH3 de la fodrine par la technique du double-hybride. 29 partenaires ont été identifiés, regroupés en 19 familles et 10 clones isolés. La spécificité des interactions a été étudiée à la fois par double-hybride, à l'aide de mutants du domaine SH3 de la fodrine produits par mutagenèse dirigée. Les interactions vis-à-vis d'autres domaines SH3 (spectrine ou une protéine de levure non relatée Scd2) ont été également analysées. Enfin, la spécificité de certains partenaires a été confirmée par des études d'interactions in vitro. Deux des protéines les plus spécifiques du domaine SH3 de la fodrine sont des protéines tyrosine-phosphatase PTP. La première est l'isoforme A de PTP de faible poids moléculaire (LMPTPA) mais l'interaction n'a pas été confirmée in vitro. La deuxième, TD14, est une nouvelle PTP dont la seule fonction connue est d'inhiber la formation des foyers tumoraux des cellules surexprimant l'oncogène Ha-ras. Ces PTP pourraient soit déphosphoryler la fodrine, soit être recrutées sous la membrane pour déphosphoryler une autre cible. Nous avons également identifié trois partenaires (N-WASP, Evl et une protéine de la famille des formines) suggérant que les domaines SH3 des spectrines pourraient être impliqués dans les processus de polymérisation de l'actine liés à la mobilité ou la différenciation cellulaire. Mot clés : spectrine, fodrine, tétramérisation, SH3, double-hybride, polymérisation de l'actine
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00284819 |
| Date | 09 December 1999 |
| Creators | Nicolas, Gaël |
| Publisher | Université Paris-Diderot - Paris VII |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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