El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la
modulación de las funciones biológicas de los osteoblastos, células
responsables de la formación de hueso, es indispensable como punto de
partida para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas aplicables en las
patologías óseas. La acción del trifosfato de adenosina (ATP) sobre los
receptores purinérgicos de la membrana plasmática ha mostrado regular
importantes funciones celulares de los osteoblastos.
Los resultados expuestos en esta Tesis describen por primera vez, el
efecto del ATP sobre la expresión de proteínas inductoras de formación de
hueso en osteoblastos de calvaria de rata (OBCs), como así también la
modulación de dicho suceso por la infección con los virus de Sarampión (MEV)
y Junín (JUNV). Mediante diferentes técnicas, como ensayos de proliferación,
determinación de deposiciones de calcio, citometría de flujo y reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real, se demostró que la activación por ATP
de los receptores P2Y2 estimula la proliferación y diferenciación de los OBCs.
Además, se observó que estos receptores modulan positivamente la expresión
de proteínas asociadas a la diferenciación osteoblástica como las proteínas
morfogenéticas óseas (BMP-2, 4, 5 y 7), sialo-proteína ósea, colágeno y
fosfatasa alcalina. Se demostró la participación de la vía de la fosfatidil inositol
3 quinasa / proteína quinasa B (PI3K/AKT) en la estimulación inducida por el
ATP sobre la proliferación y diferenciación de los OBCs. También, el empleo de
diferentes nucleótidos sugiere que la expresión génica de BMP-1, 3, y 6 estaría
regulada por los subtipos P2Y6, P2Y4,1,12,13 y P2Y6,1,12,13 respectivamente.
Además, por técnicas de microscopía convencional y de fluorescencia, western
blot y ensayos de infectividad, se demostró que MEV o JUNV pueden infectar a
los OBCs y modular la expresión de varias proteínas relacionadas con la
diferenciación de los osteoblastos. La infección con MEV mostró analogía con
datos reportados en la literatura, de biopsias de pacientes con otosclerosis,
enfermedad de los huesecillos del oído que causa sordera. Sin embargo, a
diferencia de lo observado para el tratamiento con ATP, esta modulación no
ocurre a través de la vía PI3K/AKT. La activación de los receptores P2Y1, 12, 13
inhibe la multiplicación o liberación de MEV. En cambio en el caso de los OBCs
infectados con JUNV, los tratamientos con nucleótidos no modificaron los
títulos virales, sin embargo, generaron péptidos truncados derivados de la
nucleoproteína viral característicos de la infección persistente de cultivos
celulares por JUNV. Asimismo, se comprobó la capacidad de JUNV de infectar
persistentemente a los OBCs. Estos resultados permiten especular acerca de
las probables alteraciones inducidas por el virus en la respuesta de los OBCs a
estímulos externos y ubica a estos sistemas virus-célula como modelos de
estudio de enfermedades óseas de probable etiología viral como la
otosclerosis. Los resultados aquí presentados contribuyen a la comprensión de los
mecanismos involucrados en la modulación de la proliferación y maduración de
osteoblastos por receptores purinérgicos y también como respuesta a la
infección viral. / The knowledge of molecular mechanisms involved in the modulation of
osteoblasts biological functions, cells responsible for bone formation, is
essential as a starting point to design new therapeutic strategies applicable in
bone diseases. The adenosine triphosphate (ATP) action on purinergic
receptors of plasma membrane has shown to regulate important cellular
functions in osteoblasts. The results presented in this thesis describe, for the first time, the ATP
effect on the expression of proteins related to bone formation in rat calvarial
osteoblasts (OBCs), as well as the modulation of this event when infected with
Measles (MEV) and Junin (JUNV) virus. Using different techniques, such as
proliferation trials, calcium deposition determination, flow cytometry and realtime
quantitative polymerase chain reaction, it was demonstrated that the P2Y2
receptor activation by ATP, stimulates OBCs proliferation as well as
differentiation. Moreover, it was observed that these receptors positively
modulate those proteins associated with osteoblast differentiation such as bone
morphogenetic proteins (BMP-2, 4, 5 and 7), bone sialoprotein, collagen and
alkaline phosphatase. It has been demonstrated that the phosphatidyl inositol 3
kinase / protein kinase B (PI3K/AKT) pathway is involved in the proliferation and
differentiation of OBCs. The use of different nucleotides also suggests that
BMP-1, 3, and 6 gene expression would be regulated by P2Y6, P2Y4, 1, 12, 13 and
P2Y6, 1, 12 and 13 subtypes receptors respectively. In addition, by conventional
microscopy and fluorescence techniques, western blot and infectivity assays, it
was demonstrated that both viruses are able to infect OBCs and modulate
several proteins related to these cells differentiation. These results are in
accordance with reports dealing with biopsies from patients suffering
otosclerosis, a human disease of the ear ossicles which causes hearing
impairment. However, by contrast to that observed for the treatment with ATP,
viral modulation does not occur via PI3K/AKT. The P2Y1, 12, 13 receptors
activation inhibit the MEV release or multiplicity; however in the case of OBCs
infected with JUNV, the treatments with different nucleotides did not modify the
viral titer but it induced the appearance of truncated peptides derived from the
viral nucleoprotein, a salient feature of persistent infection of JUNV in vitro. In
addition and accordance to the results shown here, JUNV was able to infect
OBCs, persistently. On the other hand, results allow speculation about the viral
modulation of OBCs response to external stimuli and the perspectives of viruscell
systems as useful models in the study of otosclerosis, a bone disease
associated to viral infection. The results presented here contribute to understand the mechanisms
involved in the modulation of proliferation and maturation in osteoblasts by
purinergic receptors as well as in response to viral infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/471 |
| Date | 20 March 2014 |
| Creators | Ayala Peña, Victoria Belén |
| Contributors | Santillán, Graciela Edith, Scolaro, Luis A. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 0 |
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