A degradação enzimática rápida, eficiente e robusta de polissacarídeos derivados de biomassa lignocelulósica é atualmente um grande desafio na produção de biocombustíveis e considerada uma alternativa viável e promissora para se enfrentar a crise energética mundial e diminuir a dependência das fontes fósseis de energia. O bagaço de cana-de-açúcar no Brasil é a principal matéria lignocelulósica sustentável de grande potencial para a produção do etanol de 2ª geração. O principal requisito para a consolidação dessa abordagem é a disponibilidade de enzimas que hidrolisam a celulose, hemicelulose e outros polissacarídeos em açúcares fermentescíveis e em condições adequadas para a utilização industrial. O presente estudo visou à caracterização molecular, estrutural e funcional da endoglucanase GH12 do fungo Aspergillus terreus (AtGH12) por diferentes técnicas. O gene que codifica para essa enzima foi clonado e expressado no fungo filamentoso A. nidulans linhagem A773. A cepa com maior secreção foi selecionada e a sequência da enzima confirmada por espectrometria de massas MALDI TOF MS. Posteriormente, através de estudos funcionais de parametrização enzimática como pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, efeitos supressores e potencializadores de aditivos, a enzima AtGH12 foi caracterizada bioquímica e fisicamente. A espectrometria de massas do substrato hidrolisado pela catálise enzimática foi tomada como uma forma de investigar o padrão de clivagem da hidrólise e estudo do reconhecimento enzima/substrato para a AtGH12. As caracterizações estruturais das enzimas recombinantes obtidas utilizando as técnicas de espalhamento dinâmico de luz, dicroísmo circular, espalhamento de raios X a baixo ângulo e gel nativo serviram para determinação do enovelamento e estado oligomérico em solução da AtGH12. Com o intuito de fornecer subsídios para o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos mais eficazes para hidrólise da biomassa lignocelulósica, a atividade da AtGH12 foi avaliada frente ao bagaço de cana-de-açúcar pré-tratados pelos processos hidrotérmicos e organossolve. Posteriormente, o seu grau de sinergismo nesse tipo de substrato foi determinado com o coquetel enzimático comercial Acellerase®. / Fast, more efficient and robust enzymatic degradation of lignocellulosic biomassderived polysaccharides is currently a major challenge in the production of biofuels and considered a feasible and promising alternative to confront the global energy crisis and reduce the dependence on fossil energy resources. The sugarcane bagasse in Brazil is the most abundant and sustainable lignocellulosic material for the production of 2nd generation ethanol. The main requirement for the consolidation of this approach is the availability of enzymes that hydrolyze cellulose, hemicelluloses and other polysaccharides into fermentable sugars suitable for industrial use. The present study was aimed at molecular, structural and functional characterization of an endoglucanase from the fungus Aspergillus terreus (AtGH12) using different techniques. The gene encoding this enzyme has been cloned and expressed in the filamentous fungus Aspergillus nidulans strain A773. The strain with increased secretion was selected and the enzyme sequence was confirmed by mass spectroscopy MALDI TOF MS. Later, functional studies such as analysis of optimal pH and temperature, thermal stability, suppression and enhance effects of additives were applied to the AtGH12 characterization. The mass spectrometry of hydrolyzed substrate from the enzyme catalysis was acquired as a way to investigate the cleavage pattern of hydrolysis and the study of the enzyme/substrate interaction. Structural characterization of the recombinant enzymes was obtained using techniques such as dynamic light scattering, circular dichroism as well as small angle X-ray scattering and native gel, aided to determine the folding and oligomeric state of AtGH12 in solution. In order to provide support for the development of more effective enzyme cocktails for hydrolysis of lignocellulosic biomass, the activity of AtGH12 was evaluated using sugarcane bagasse pretreated by hydrothermal and organosolv processes. Subsequently, the degree of synergism in this type of substrate was measured using a commercial enzyme cocktail Acellerase®.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07052015-085141 |
| Date | 23 February 2015 |
| Creators | Mulinari, Evandro José |
| Contributors | Muniz, João Renato Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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