The genus Borrelia is a widespread, pathogenic pest and the causative of among others borreliosis or Lyme disease. The vector for the bacteria is the hard tick, Ixodes ricinus and the infection is transferred through a bite. Untreated, Borrelia may cause arthritis, heart damage or neuroborreliosis. Infection is made possible through different strategies for avoiding the body’s complement system. One such strategy involves the binding of factor H to specific bacterial membrane proteins and, thus, no complement activation and lysis. Another defence mechanism, phagocytosis, acts in cooperation with the complement and is subsequently retarded. The present study includes optimizing of Borrelia culturing, characterisation of different Borrelia strains in regard to sensitivity against the complement including culture counting and the analysis of free C3a and the Terminal Complement Complex (TCC). Further, tagging with FITC in order to study morphology as well as phagocytosis with the aid of microscopy and FACS was performed. The culturing experiments showed Borrelia to be rather easy to culture, although a strict sterile technique has to be applied. Concerning sensitivity to complement, the B.afzelii strains showed to be resistant to complement action, while most of the B. garninii are sensitive. Analysis of C3a and TCC after incubation with normal human blood serum as well as human whole blood, showed that complement activation demands rather or very high cell densities. Tagging with FITC followed by microscopic analysis resulted in good illustrations of the bacterial morphology. The FACS analysis resulted in findings of phagocytosis in both monocytes and granulocytes and, further, the different stages of phagocytosis were visualised through nuclear staining followed by microscopy. The genus Borrelia is a widespread, pathogenic pest and the causative of among others borreliosis or Lyme disease. The vector for the bacteria is the hard tick, Ixodes ricinus and the infection is transferred through a bite. Untreated, Borrelia may cause arthritis, heart damage or neuroborreliosis. Infection is made possible through different strategies for avoiding the body’s complement system. One such strategy involves the binding of factor H to specific bacterial membrane proteins and, thus, no complement activation and lysis. Another defence mechanism, phagocytosis, acts in cooperation with the complement and is subsequently retarded. The present study includes optimizing of Borrelia culturing, characterisation of different Borrelia strains in regard to sensitivity against the complement including culture counting and the analysis of free C3a and the Terminal Complement Complex (TCC). Further, tagging with FITC in order to study morphology as well as phagocytosis with the aid of microscopy and FACS was performed. The culturing experiments showed Borrelia to be rather easy to culture, although a strict sterile technique has to be applied. Concerning sensitivity to complement, the B.afzelii strains showed to be resistant to complement action, while most of the B. garninii are sensitive. Analysis of C3a and TCC after incubation with normal human blood serum as well as human whole blood, showed that complement activation demands rather or very high cell densities. Tagging with FITC followed by microscopic analysis resulted in good illustrations of the bacterial morphology. The FACS analysis resulted in findings of phagocytosis in both monocytes and granulocytes and, further, the different stages of phagocytosis were visualised through nuclear staining followed by microscopy. / Bakteriegruppen Borrelia burgdorferi har en stor utbredning och förorsakar sjukdomen borreliosis, även kallad Lyme disease, som orsakar mycket lidande. Sjukdomen är en zoonos och smittämnet, bakterien, sprids via en vektor, fästingen Ixodes ricinus. Både människor och djur kan smittas i samband med bett från fästingen. Sjukdomen borreliosis börjar oftast som en lokal hudinfektion med ett karakteristiskt utslag, erythema migrans. Utslaget uppvisar en blek mittregion som omges av en rodnad, 4 – 5 cm i diameter. Antibiotikabehandlig är ofta framgångsrik. Utan behandling kan sjukdomen få allvarliga konsekvenser med påverkan på leder, hjärta, andra organ och centrala nervsystemet (CNS). Hur bakterierna lyckas sprida sig i kroppen och orsaka kroniska tillstånd är ännu inte kartlagt. Det har dock visats att en del av borreliaarterna har en utvecklad strategi för att undgå en del av kroppens immunförsvar genom inaktivering av komponenter i komplementsystemet. Komplementsystemet utgör en del av kroppens immunförsvar och består av ett 30-tal lösliga proteiner i inaktiv form. Vid aktivering till exempel vid invasion av mikrober interagerar proteinerna med varandra och generar produkter, som i sin tur resulterar i olika effektorfunktioner. I samband med proteolytisk aktivitet frisätts mindre produkter, som kan inducera kärlvidgning, agera som kemotaktiskt stimuli för fagocyterande celler och inducera opsonisering. Det är sedan tidigare känt att förhållandet till komplementsystemet skiljer sig åt hos olika borreliaarter. Arter och stammar inom gruppen Borrelia burgdorferi sensu lato interagerar med proteiner från värdens komplementsystem för att på så sätt undgå komplementattack. Faktor H är exempel på ett sådant protein. Borreliabakterien kan uttrycka receptorer i sitt yttermembran, som binder in denna faktor. Vid medverkan av faktor H dämpas komplementaktiveringen och bakterien kan undgå lys. Målet med föreliggande studie var att optimera odlingsbetingelserna för Borrelia följt av kartläggning av olika stammar av Borrelia burgdorferi sensu lato avseende känslighet respektive resistens mot serumkomplement och dess beroende av serumkoncentration respektive bakterietäthet. Vidare skulle grad av komplementaktivering för olika stammar bedömas, liksom inmärkning med FITC följt av mikroskopisk och/ eller FACS - analys för studium av morfologi och fagocytos. För bedömning av känslighet respektive resistens för olika stammar gentemot komplementsystemet, genomfördes räkning av levande bakterier genom faskontrastmikroskopi. Resultaten avseende bakteriehalter kontra komplementaktivering analyserades med hjälp av ELISA-teknik och analys av lösligt C3a respektive lösligt Terminal Complement Complex (TCC). Samtliga i projektet ingående borreliastammar, med ett undantag Borrelia garninii Pbi, befanns vara lättodlade under förutsättning av sträng sterilteknik och upprepad subkultivering. En förklaring till problemet med B. garninii Pbi kan vara en observerad längre lagfas. Observation är subjektiv utan experimentell studie. Resultaten av räkning av överlevande bakterier som mått på känslighet/resistens mot komplementsystemet i humant normalserum visade att samtliga Borrelia afzelii – stammar var resistenta medan flertalet Borrelia garninii - stammar var känsliga. Resultaten från analyser av fritt C3a och TCC efter inkubering med NHS visar att komplementaktivering sker först vid ökande och mycket höga bakterietätheter. Försök med inkubering med NHS respektive hirudinbehandlat helblod visade inte på någon nämnvärd skillnad i utfall. FITC-inmärkning av B. afzelii K78 och B. garninii Lu59 resulterade i goda illustrationer av spiroketernas morfologi. FACS -analys av fagocyterade inmärkta bakterier visade att både monocyter och granulocyter har förmåga att fagocytera borreliabakterier och att EDTA märkbart hämmade fagocytosen. Vidare tycks B. afzelii K78 fagocyteras i något större omfattning än B. garninii Lu59. De olika stadierna i fagocytosförloppet framgår av den mikroskopiska analysen av kärninfärgade preparat / Borrelia, Faktor H, Odling, Bakterier
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:lnu-11448 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Bagert, Bodil |
| Publisher | Högskolan i Kalmar, Naturvetenskapliga institutionen |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Swedish |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0028 seconds