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Previous issue date: 2017-02-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A mastite é considerada um grande problema na pecuária leiteira e o uso frequente de antimicrobianos contribui para o aumento da pressão seletiva de micro-organismos resistentes aos principais fármacos. A Organização Mundial da Saúde Animal tem alertado para o risco da resistência antimicrobiana resultante do uso indevido de antimicrobianos no tratamento de animais doentes. O presente trabalho tem como objetivos identificar e caracterizar o perfil clonal, bem como os fatores de virulência e de resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus spp. isolados do leite de bovinos com mastite subclínica de várias regiões do Brasil. As amostras foram concedidas pela Embrapa Gado de Leite, provenientes de 6 estados brasileiros, incluindo Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco. Foram incluídas 181 amostras de Staphylococcus spp. no estudo. A identificação fenotípica revelou um total de 82 (45,3%) Staphylococcus aureus e 99 (54,7%) Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Destes, a espécie mais isolada foi S. chromogenes com 27 (14,9%) amostras, seguido de S. epidermidis com 26 (14,3%). Realizou-se a confirmação genotípica utilizando a técnica Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) de todas as amostras, demonstrando um total de 98% de concordância com o teste fenotípico. Quanto à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), S. aureus revelou 99% de sensibilidade à oxacilina, enquanto os CoNS apresentaram 32% de resistência à esse antimicrobiano. Já para a vancomicina, todas as amostras foram sensíveis, apresentando apenas susceptibilidade reduzida pelo método de triagem, onde 13 amostras cresceram em BHI ágar com concentrações de 4μg/mL e 6 μg/mL de vancomicina. Com referência à produção de beta-lactamase foi possível observar que 96% das amostras de Staphylococcus spp. foram positivas. O gene mecA foi detectado em 8 amostras, todas do grupo CoNS e a tipagem do SCCmec revelou isolados do tipo I e tipo IV. Nas amostras em que não foram encontrados o gene mecA, foi realizada pesquisa do mecA homólogo (LGA251) e um total de 12 amostras apresentaram um produto de PCR com tamanho semelhante ao esperado para o gene mecC. No entanto o sequenciamento das amostras revelou similaridade de 99% com um gene ancestral do mecA. Através da técnica de PCR foram pesquisados os genes do operon ica responsáveis pela produção de biofilme,sendo detectados o gene icaA em 79 amostras (43,6%), o icaB em 24 (13,2%), o icaC em 57 (31,4%) e o icaD em 127 (70,1%). O gene bap foi detectado em 66 amostras (36,4%), enquanto o gene bhp foi encontrado apenas em 9 (4,9%) amostras de S. epidermidis. Já os ensaios de expressão por RT-qPCR comprovaram a expressão do gene icaA em 60 amostras (33%) do icaB em 6 (3,3%), do icaC em 26 (14,3%) e do icaD em 80 (44%). Quanto aos genes de enterotoxinas, o estudo revelou o gene sea como o mais frequente, sendo detectado em 18,2% das amostras, o gene seb em 7,7%, o sec em 14,9%, o sed 0,5%, o see em 8,2%, o sei em 6,6%, e o ser em 1,6%. Os genes ses, set e tst não foram detectados em nenhuma das amostras. A tipagem do perfil clonal das amostras pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis permitiu a identificação de oito clones de S. aureus que incluíram simultaneamente, ≥3 amostras, com similaridade ≥80%. Em relação às outras espécies estudadas, houve a formação de três grupamentos para a espécie S. chromogenes, enquanto para S. epidermidis quatro clusters foram detectados. Já ao analisar S. saprophyticus, foi possível observar apenas um grupamento. Quanto ao Multilocus Sequence Type (MLST) para o sequenciamento dos sete genes housekeeping, os ST prevalentes em S. aureus foram ST126 e ST1 enquanto em S. epidermidis, os ST foram todos distintos. / Mastitis is considered a major problem in dairy farming and the frequent use of antimicrobials contributes to increased selection pressure of resistant micro-organisms to the main drugs. The World Organisation for Animal Health are aimed at the protection of animal and human health against the risk of antimicrobial resistance resulting from the treatment of sick animals. This study aims to identify and characterize the clonal profile and the virulence as well as the virulence factors and the antimicrobial resistance to Staphylococcus spp. isolated from bovine milk with subclinical mastitis from several regions of Brazil. The samples were provided by Embrapa Gado de Leite (Embrapa Dairy Cattle), from 6 Brazilian states, including Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo and Pernambuco. A total of 181 samples of Staphylococcus spp. were included in the study. Phenotypic identification revealed a total of 82 (45.3%) Staphylococcus aureus and 99 (54.7%) Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) and, of these, the most isolated species was S. chromogenes with 27 (14.9%) samples, followed by S. epidermidis with 26 (14.3%). We realized the genotypic confirmation by using the technique Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) of all samples, demonstrating a total of 98% of concordance with the phenotypic test. As for the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), S. aureus showed 99% of susceptibility to oxacillin, while CoNS showed 32% resistance to this drug. As for vancomycin, all samples were susceptible, by displaying only reduced susceptibility screening method, where 13 samples grown on BHI agar at concentrations of 4μg/mL and 6 g/mL of vancomycin. With reference to the production of beta-lactamase was observed that 96% of Staphylococcus spp. strains were positive. The mecA gene was detected in 8 samples, all of CoNS group and typing of isolates revealed SCCmec type I and type IV. In the samples that were not found mecA gene, an homologous mecA (LGA251) survey was conducted and a total of 12 samples showed a PCR product with size similar to that expected for mecC gene. However, the sequencing of the samples revealed a similarity of 99% with an ancestral gene mecA. Through PCR technique were investigated genes of the ica operon responsible for the production of biofilm, being detected icaA gene in 79 samples (43.6%), the icaB in 24 (13.2%), icaC in 57 (31 , 4%) and icaD in 127 (70.1%). The bap gene was detected in 66 samples (36.4%), while bhp gene was found only in 9 (4.9%) samples of S. epidermidis. Yet, the expression assays by RT-qPCR demonstrated the expression of icaA gene in 60 samples (33%), of icaB 6 (3.3%) of icaC in 26 (14.3%) and icaD 80 (44 %). As for enterotoxin genes, the study revealed the sea gene as the most frequent, being detected in 18.2% of samples, the seb gene in 7.7%, sec in 14.9%, sed 0.5% , see in 8.2%, sei at 6.6% and the ser in 1.6%. The ses, set and tst genes were not detected in any of the samples. The typing of clonal profile of the samples by the Pulsed Field Gel Electrophoresis technique, permitted the identification of eight clones of S. aureus, included both ≥3 samples, with ≥80% similarity. For the other species studied, there was the formation of three groups for the S. chromogenes species, while for S. epidermidis, four clusters were detected. Have to analyze S. saprophyticus, we observed only one grouping. As for the Multilocus Sequence Type (MLST) that is the sequencing of seven housekeeping genes, the ST prevalent in S. aureus were ST126 and ST1 while in S. epidermidis, the ST were all different. / FAPESP: 2012/24135-0
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unesp.br:11449/150897 |
| Date | 21 February 2017 |
| Creators | Mello, Priscila Luiza [UNESP] |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista (UNESP), Cunha, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da [UNESP] |
| Publisher | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNESP, instname:Universidade Estadual Paulista, instacron:UNESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 600 |
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