Observa-se, atualmente, um aumento no interesse por alimentos funcionais e isto tem levado pesquisadores a investigar o potencial antioxidante de diversas frutas e de diversos compostos fenólicos presentes nos alimentos. As pesquisas a cerca da atividade antioxidante de pêssegos e nectarinas são escassas quando comparada às frutas vermelhas, apesar de aqueles frutos conterem importantes compostos fenólicos, como o ácido clorogênico, que apresenta efeitos potencialmente benéficos à saúde derivados de sua ação antioxidante. Entretanto, dados a respeito do seu conteúdo em frutas, vegetais, alimentos processados e sua distribuição em diferentes tecidos de plantas são escassos. O potencial antioxidante reativo total (TRAP) é um dos métodos mais utilizados para estimar a capacidade antioxidante de amostras in vitro. Entretanto, este método apresenta limitações quando a amostra não apresenta a fase lag (ou tempo de indução) necessária para obter o valor do TRAP pelo método original. Esse comportamento é obtido em algumas amostras e em substâncias isoladas, mas não em muitos extratos, os quais possuem diversas substâncias antioxidantes. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi otimizar e validar o método TRAP original e propor outro método de avaliação utilizando a Área Sob a Curva (AUC) e empregar essa ferramenta para avaliar o potencial antioxidante de extratos de pêssego (cascas e polpas) de três cultivares e do ácido clorogênico na mesma concentração encontrada no extrato. Para desenvolver esse trabalho, o primeiro passo foi otimizar e validar o método TRAP alternativo utilizando 2,2'-azo-bis (2- amidinopropano) (AAPH) como fonte de radical livre e um cintilador líquido para monitorar a quimiluminescência amplificada pelo luminol após a adição da amostra antioxidante. O método cromatográfico para quantificar o ácido clorogênico foi realizado usando uma coluna C-18 e sistema gradiente de eluição com acetonitrila-água-ácido trifluoracético. A detecção foi realizada por ultravioleta a 327 nm e a identificação do pico foi baseada no tempo de retenção, por coinjeções com a substância de referência e por LC-MS-MS. A principal condição estabelecida para o método TRAP foi a necessidade de estabilização do sistema (7000 segundos) antes da adição do antioxidante a ser testado. Todos os parâmetros da validação mostraram resultados satisfatórios: especificidade, linearidade (r > 0,99), precisão (intra e inter-dia – desvio padrão relativo menos que 5%), robustez e os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram baixos e similares para ambos os métodos de avaliação. O método cromatográfico para quantificar o ácido clorogênico apresentou boa linearidade (r > 0,99), repetibilidade (RSD < 2%) e recuperação (96,3%, RSD = 1,96%) e foi robusto para pequenas variações nos parâmetros testados (RSD < 2%). Os resultados obtidos usando a AUC mostraram que os extratos de cascas e polpas das cultivares Maciel, Leonense e Eldorado apresentaram atividade de seqüestro de radicais livres em todas as concentrações testadas, com uma ação concentraçãodependente. A inibição imediata da quimiluminescência e a duração desta inibição foram significativamente maiores no extrato em relação ao composto majoritário (ácido clorogênico) isolado e isto pode ser devido a um efeito sinérgico ou aditivo de outros antioxidantes presentes no extrato. O IC50 para o extrato de pêssego e ácido clorogênico foi 1,19 μg/mL e 8,43 μg/mL, respectivamente, quando o TRAP foi avaliado e um IC50 de 0,41 μg/mL e 1,89 μg/mL foi obtido quando o TAR (Reatividade Antioxidante Total) foi avaliado com o extrato de pêssego e com o ácido clorogênico, respectivamente. O ácido clorogênico apresentou uma importante contribuição ao potencial e à reatividade antioxidantes, mas os extratos do fruto contribuem com uma ação antioxidante mais duradoura. A principal vantagem da utilização da AUC para avaliar a atividade antioxidante é a maior precisão desse método e seu uso em amostras que não apresentam fase lag, como os extratos de pêssego, os quais apresentaram importante atividade antioxidante e, portanto, podem proporcionar vantagens à saúde de consumidores que ingerem essa fruta. / Increasing recent interest in nutraceuticals and functional foods has led researchers to investigate the antioxidant potential of several fruits and of several phenolic compounds. The researches about antioxidant activity of peaches and nectarines are scarce when compared to red fruits despite of they contain important phenolic compounds as chlorogenic acid, which present potential beneficial effect in humans derived from its antioxidant activity. However, data on its content in fruits, vegetables, foods processing, and its distribution in different tissues of plants is scarce. The total reactivity antioxidant potencial (TRAP) method is one of the methods most employed to estimate the antioxidant capacity of samples in vitro. However, this method can presents limitations when the sample does not present a lag phase (or induction time) which is necessary to get TRAP value by original method. This behavior is got in some samples and to isolated substances, but not in many extracts which have several antioxidants. In this context, the aim of this work was to optimize and validate the original TRAP method, and to propose another evaluation method utilizing the area under curve (AUC) and to use this tool to evaluate antioxidant potential and reactivity from peach extracts (peels and fleshes) from three cultivars and from chlorogenic acid in the same concentration founded in extract. To developed this work, the first step was to optimized and to validated the alternative method to get TRAP value using 2,2'-azo-bis (2-amidinopropane) (AAPH) as the free radical source and a liquid scintillator counter to monitored the luminol-enhanced chemiluminescence after addition of the antioxidant sample. The chromatographic method to quantifiy chlorogenic acid was performed using a C-18 column with acetonitrile-watertrifluoracetic acid gradient elution. The detection was carried out by UV at 327 nm and the peak identification was based on the retention times, by cochromatography with reference substances and by LC-MS-MS. The main condition established to TRAP method was the need for the stabilization of the system, at 7000 s, before the addition of the antioxidant to be tested. All validations parameters showed satisfactory results: specificity, linearity (r >0.99), precision (intra- and interassay - relative standard deviation were both less than 5 %), robustness, and the limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were low and similar to both evaluation methods. The chromatographic method to quantify chlorogenic acid presented good linearity (> 0.99), good repeatability (RSD < 2 %) and accuracy (96.3%, RSD = 1.96% ) and was robust to small variations in parameters tested (RSD < 2 %). The results obtained using AUC showed that the extracts of peels and fleshes of Maciel, Leonense and Eldorado peach cultivars present free radical scavenging activity in all concentrations tested, with a concentration-dependent action. The immediate inhibition of chemiluminescence and the duration of this inhibition were significantly higher in the extracts than in the major compound (chlorogenic acid) alone and it can be due to a synergistic or additive effect of other antioxidants present in the extracts. The IC50 for peach extract and chlorogenic acid were 1.19 μg/mL and 8.43 μg/mL, respectively, when TRAP was evaluated and an IC50 of 0.41 μg/mL and 1.89 μg/mL was found when TAR was evaluated in peach extract and chlorogenic acid, respectively. Chlorogenic acid presented a good contribution to antioxidant reactivity and potential, but the fruit extracts provide better antioxidant action. The main advantage of utilization of AUC to evaluate antioxidant activity is the higher precision of this method and its use in samples that do not present lag phase, as peach extracts which presented important antioxidant activity and therefore, it may provide health-promoting advantages to consumers by intake of this fruit.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/28747 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Rossato, Simone Bertazzo |
| Contributors | Zuanazzi, Jose Angelo Silveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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