Au cours de cette thèse, nous avons été amenés à développer des méthodes analytiques afin de contrôler la qualité de protéines thérapeutiques en tant que produits finis ou d'évaluer le potentiel de certaines protéines à être des candidats médicaments. Deux protéines ont été étudiées : l'albumine de sérum humain (HSA) et l'antithrombine (AT). Ces protéines diffèrent par leur structure, leur glycosylation et leurs activités biologiques. Une méthode d'électrophorèse capillaire de zone (CZE) a permis de séparer neuf formes dans des préparations commerciales d'HSA plasmatique, dont des formes native, cystéinylée, glyquées et tronquées. Une autre méthode CZE a permis de séparer plus de huit formes dans des préparations commerciales d'AT plasmatique, dont des formes native, latente et hétérodimérique. Les deux méthodes CZE développées ont permis de mettre en évidence des différences significatives quant à la composition de préparations commerciales d'HSA ou d'AT produites par cinq fournisseurs différents. Des méthodes d'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse (CE-MS), avec un analyseur quadripôle-temps de vol (Q-TOF) et une ionisation électrospray (ESI), ont également été développées. Ces méthodes CE-MS ont permis d'identifier non seulement de nombreuses glycoformes et formes apparentées de l'AT, mais également des formes dimériques. Une méthode CE-MS en conditions non-dénaturantes a permis de montrer que la forme native et la forme latente de l'AT (deux conformères) présentaient un spectre de masse spécifique, permettant de les différencier sans ambiguïté. Afin d'évaluer l'affinité de variants d'AT pour l'héparine, une méthode d'électrophorèse capillaire d'affinité (ACE) a été développée. Cette méthode ACE a permis d'analyser les variants d'AT directement à partir des surnageants de culture cellulaire dans lesquels ils sont produits. Ainsi, il a été montré que certains variants présentaient une affinité très élevée pour l'héparine, en accord avec les mutations réalisées. Enfin, dans le cadre des études d'affinité entre l'AT et l'héparine, nous avons exploré une méthode nouvelle basée sur l'analyse de la dispersion de Taylor (TDA). / During this Ph.D., we developed analytical methods in order to check the quality of therapeutic proteins as finished products or to assess the potential of some proteins to be drug candidates. Two proteins were studied : human serum albumin (HSA) and antithrombin (AT). These proteins are very different regarding their structure, glycosylation, and biological functions. A capillary zone electrophoresis (CZE) method enabled to separate nine forms in commercial preparations of HSA issued from human plasma, among which native, cysteinylated, glycated, and truncated forms. Another CZE method allowed separating more than eight forms in commercial preparations of AT issued from human plasma, among which native, latent, and heterodimeric forms. Both CZE methods enabled to highlight significant differences in the composition of marketed preparations produced by five competitive pharmaceutical companies. Capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS) methods, using a quadrupole-time of flight (Q-TOF) analyzer and electrospray ionization (ESI), were also developed. These CE-MS methods enabled to identify not only a high number of glycoforms and related forms of AT, but also dimeric forms. A CE-MS method developed in non-denaturing conditions showed that native and latent forms of AT (two conformers) exhibited a specific mass spectrum, allowing to unambiguously distinguish them. With the aim to assess the binding affinity of AT variants toward heparin, we developed an affinity capillary electrophoresis (ACE) method. This ACE method enabled to analyze AT variants directly from the cell culture supernatants used to produce them. It has been shown that some AT variants had a very high affinity for heparin, in good agreement with the performed mutations. Finally, a new method based on Taylor Dispersion Analysis (TDA) was investigated to study the affinity between AT issued from plasma and heparin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015SACLS044 |
| Date | 20 October 2015 |
| Creators | Marie, Anne-Lise |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Taverna, Myriam |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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