Η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί παράγοντα μεγάλης σημασίας στην οντογένεση των ιχθύων, αφού ως ποικιλόθερμοι οργανισμοί είναι συνεχώς εκτεθειμένοι στις μεταβολές του περιβάλλοντός τους. Έχει παρατηρηθεί πως η θερμοκρασία ανάπτυξης δύναται να προκαλέσει μετατόπιση του χρονοδιαγράμματος των οντογενετικών γεγονότων και πλαστικότητα σε μορφολογικούς και φυσιολογικούς χαρακτήρες (πχ στο μυοσκελετικό και το καρδιαγγειακό σύστημα). Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης του zebrafish και σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του ολικού μεταγραφικού προτύπου νυμφών zebrafish. Για το λόγο αυτό σχεδιάστηκαν δύο πειράματα, όπου τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης (22, 28 και 32oC) εφαρμόστηκαν στην πρώιμη οντογενετική περίοδο: για το διάστημα 0-20 dpf* (1ο πείραμα) και 10-20 dpf (2ο πείραμα). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA από τα άτομα ηλικίας 20 dpf όλων των πληθυσμών και από τα άτομα ηλικίας 10 dpf του πληθυσμού των 28oC του 2ου πειράματος και ακολούθησε υβριδοποίηση σε ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες Affymetrix, με 15.509 αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες γονιδίων (probe sets).
Τα 21 μεταγραφικά προφίλ επεξεργάσθηκαν με τα εξειδικευμένα προγράμματα ανάλυσης μικροσυστοιχιών, dChip και MeV (v.4.5.1). Η κανονικοποίηση και το φιλτράρισμα των δεδομένων των μικροσυστοιχιών απέδωσε μεταγραφικά πρότυπα με 9.488 probe sets. Με τεχνικές πολυπαραμετρικής στατιστικής ανάλυσης (HCL και PCA) πραγματοποιήθηκαν οι συγκρίσεις των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των πειραματικών πληθυσμών για κάθε θερμοκρασία ανάπτυξης και οντογενετικό στάδιο. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των δύο πειραμάτων, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC και στα δύο πειράματα, και iii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC διαφορετικού οντογενετικού σταδίου (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf). Θα αναμέναμε τα πρότυπα έκφρασης των 28oC να παρουσιάζουν παρόμοιο πρότυπο, κάτι που δεν παρατηρείται. Αυτό οφείλεται στο πειραματικό σφάλμα που υπεισέρχεται από το διαφορετικό χρόνο πραγματοποίησης των δύο πειραμάτων και τις ρυθμίσεις κατά την υβριδοποίηση. Έτσι πραγματοποιήθηκε η κανονικοποίηση των “28”, που απαλείφει το πειραματικό σφάλμα. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC ως αποτέλεσμα της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 22oC των δύο πειραμάτων ως αποτέλεσμα της επίδρασης της περιόδου εφαρμογής και διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής και iii) σαφή διαχωρισμό των πρότυπων των 28oC (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf) ως αποτέλεσμα της επίδρασης του οντογενετικού σταδίου. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ανάλυση σημαντικότητας (SAM) και λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση (λογισμικό DAVID) των στατιστικώς σημαντικών γονιδίων που διαφοροποιούν τα πρότυπα. Η ανάλυση των γονιδίων, ως προς την ιστοειδική έκφραση ανέδειξε γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη του ματιού, των θωρακικών πτερυγίων και του εγκεφάλου στους πληθυσμούς των 22oC έναντι των 28oC και 32oC.
Η παρούσα εργασία αποδεικνύει την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής, καθώς επάγει μηχανισμούς πλαστικότητας στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Τέλος, υποδεικνύεται πως η πρώιμη οντογενετική περίοδος τείνει να είναι περισσότερο θερμοευαίσθητη, καθώς παρατηρείται εντονότερη επίδραση της θερμοκρασίας (στην περίπτωση των 22οC)στην ανάπτυξη του ατόμου.
*dpf: days post fertilization / Developmental temperature plays a principal role in the ontogeny of fish. It is known that developmental temperature may shift the initiation time of the ontogenetic stages and induce plasticity in morphological and physiological characters e.g. the musculoskeletal and the cardiovascular system. However, its effect on the gene expression pattern has not previously been attempted for zebrafish. In the present study, zebrafish Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets were used to map the transcriptome profile of: a) 20 dpf* old zebrafish larvae at three developmental temperatures, i.e. 22oC, 28oC and 32oC (1st experiment) and b) 20 dpf old zebrafish larvae, which were all grown at 28oC for the first 10 days and subsequently divided into three groups, which were grown at 22oC, 28oC and 32oC, respectively; the profile of 10 dpf old larvae was also measured (2nd experiment). We have isolated total RNA from the above populations and then, hybridization of RNA samples has been done on oligonucleotide Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets.
All 21 profiles were normalized and filtered (dChip software), and multivariate statistical analysis techniques were used on the normalized 9,488 probe set expression profiles (TM4 MeV software). Hierarchical Clustering (HCL) and Principal Component Analysis (PCA) on expression profiles indicated: a) clear separation of the two experiments based on their transcriptomic patterns, b) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC in both experiments and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. We would expect expression profiles of 28oC to be clustered together, though this was not observed because of experimental parameters during the hybridization, as the two experiments were carried out independently on different dates. So the normalization of “28” profiles took place, in order to eliminate the experimental noise. HCL and PCA, then, indicated: a) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC, as the effect of developmental temperature, b) clear separation of 22oC profiles of the two experiments, based on the effect of the period and duration of thermal conditions and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. Then, Significant Analysis of Microarrays (SAM) and Functional Genomic Classification Analysis (DAVID software) of statistically significant genes was carried out. Analysis of genes based on tissue-specific expression indicated characteristic genes for the development of the eye, pectoral fins and brain in 22oC profiles versus 28oC and 32oC profiles.
The present study has proved that thermal effect is determinative among the early ontogenetic stage, especially in the case of longer cold thermal period, and developmental temperature may induce plastic response of gene expression, that could affect the fate of fish.
*dpf: days post fertilization
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5366 |
| Date | 18 July 2012 |
| Creators | Συμεωνίδη, Διονυσία |
| Contributors | Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Symeonidi, Dionysia, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Κλάπα, Μαρία, Κουμουνδούρος, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0118 seconds