In the current thesis, spatio-temporal evaluation of the endogenous angiogenic response to ischemia was perfomed. After vascular occlusion, ischemic angiogenesis is an important reparative mechanism and can ameliorate the outcome of ischemic disease. Diabetic foot ulcers affect almost 15% of diabetic patients and are the leading cause of amputations worldwide (Yoon et al., 2005). Diminished blood flow because of atherosclerotic occlusive disease of the peripheral arteries of diabetic patients, in conjunction with anatomic and functional microcirculatory impairments contribute to development of trophic ulcerations, infections and gangrene of the lower extremities, frequently requiring amputation of the leg (Sasso et al., 2005). Numerous studies have confirmed the impaired post-ischemic angiogenesis in diabetes (Yoon et al., 2005; Sasso et al., 2005). Consequently, wound healing patterns are disturbed in diabetes mainly due to decreased ischemia-driven angiogenesis (Yoon et al., 2005). Integrin ανβ3 is a promising imaging target of angiogenic activity which is up-regulated on activated endothelial cells (ECs) but not on quiescent ones. Molecular imaging (MI) of ανβ3 integrin expression with the aid of a dedicated high resolution gamma camera, is a very sensitive imaging approach for the evaluation of angiogenesis in the rabbit hindlimb ischemia model. Furthermore, diabetes mellitus (DM) was induced, to study the effects of this pathology on the spatio-temporal distribution of angiogenesis. In order to evaluate the whole spectrum of endogenous process of collateralization after occlusion of an artery, Digital Subtraction Angiography (DSA) was also used for the visualization of larger collaterals.
During the first part of the study DM experimental protocol was investigated in order to find the appropriate protocol for the induction of long-term diabetic animal model, as it is a methodology that has not yet been standardized. At the same time a cohort of animals underwent endovascular embolization for the establishment of hindlimb ischemia and were imaged with the aid of a MI radiotracer technique in order to deal with unresolved issues and establish the imaging protocol. The study included seven New Zealand White (NZW) rabbits that underwent unilateral percutaneous endovascular embolization of the femoral artery, for the establishment of hindlimb ischemia that triggers the endogenous process of collateralization. The contralateral limb was not embolized and served as a control. The employed radiotracer for angiogenesis imaging, was a 99mTc labeled cyclic RGD peptide [c RGDfk-His]-99mTc that binds specifically to ανβ3 integrin via the three amino acid sequence Arginine-Glycine-Aspartic acid or RGD. Image acquisition was performed with a high resolution gamma camera and all animals underwent molecular imaging on the 3rd and the 9th day post-embolization. In all animals DSA was performed on the 9th day post-embolization.
The acquired images demonstrated that retention of the radiotracer at the ischemic tissue is remarkably increased compared to the non-ischemic hindlimb (normal limb) (16020 ± 2309 vs. 13139 ± 2493 on day 3; p=0.0014 and 21616 ± 2528 vs. 13362 ± 2529 on day 9; p<0.0001, respectively). In addition, radiotracer retention in normal limbs seems to be increased at day 9 in normal limbs compared to day 3 (p=0.0112). DSA at day 9, demonstrated that the mean vessel length detected was significantly superior in the normal compared to the ischemic limb (mean value 3680 ± 369.8 vs.2772 ± 267.7; p< 0.0001, respectively).
Angiogenesis was successfully detected using a 99mTc labeled cyclic RGD peptide MI technique and was significantly more pronounced in the ischemic compared to normal limbs, both at day 3 and day 9 after embolization. The peak of the phenomenon was detected at day 9. Increased mean vessel length in the normal compared to the ischemic limb demonstrates that although angiogenesis is pronounced in day 9, arteriogenesis is not sufficiently pronounced and that the phenomenon of arteriogenesis has just initiated.
The study of the angiogenic response to ischemia, has not yet been completed as MI of diabetic animals with hindlimb ischemia is underway and not completed due to many difficulties and delay in different phases of the experiment. With the conclusion of the MI of diabetic animals with hindlimb ischemia, the study will be completed and we expect to demonstrate the effect of DM on the spatio-temporal pattern of angiogenesis, providing a valuable tool in clinical practice for the precise and early diagnosis and therapy assessment of the ‘diabetic foot’. / Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η χωρο-χρονική εκτίμηση της ενδογενούς αγγειογενετικής διαδικασίας ως απόκριση στο ερέθισμα της προκλητής ισχαιμίας. Μετά από απόφραξη αρτηρίας, η επαγόμενη αγγειογένεση είναι ένα σημαντικός μηχανισμός αποκατάστασης που μπορεί να περιορίσει το αποτέλεσμα της ισχαιμίας. Το έλκος του ‘διαβητικού ποδιού’ εμφανίζεται στο 15% περίπου των ασθενών που πάσχουν από διαβήτη και αποτελεί την κύρια αιτία ακρωτηριασμού του κάτω άκρου, μετά τα ατυχήματα (Yoon et al., 2005). Η μειωμένη αιματική ροή λόγω της αποφρακτικής αρτηριοπάθειας που οφείλεται στην αθηροσκληρωτική προσβολή των περιφερικών αρτηριών των διαβητικών, σε συνδυασμό με ανατομική και λειτουργική φθορά του αγγειακού δικτύου της μικροκυκλοφορίας, οδηγούν στην ανάπτυξη ελκών, μολύνσεων και γάγγραινας των κάτω άκρων που πολύ συχνά οδηγεί στον ακρωτηριασμό του ποδιού (Sasso et al., 2005). Πολυάριθμες μελέτες όμως έχουν δείξει ότι η αγγειογένεση που επάγεται από κρίσιμη ισχαιμία, στην παθολογία του διαβήτη δεν είναι φυσιολογική (Yoon et al., 2005; Sasso et al., 2005). Συνεπώς στον διαβήτη και ο μηχανισμός επούλωσης πληγών δεν συμβαίνει φυσιολογικά κυρίως λόγω ελαττωματικής ενδογενούς αγγειογένεσης ως απόκριση στην ισχαιμία (Yoon et al., 2005). Το μόριο της ιντεγκρίνης ανβ3 υπερεκφράζεται στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα που συμμετέχουν στην αγγειογενετική διαδικασία αλλά όχι στο ανενεργό ή αλλιώς «σιωπηλό» ενδοθήλιο. Συνεπώς αποτελεί έναν πολύ καλό μοριακό στόχο για απεικόνιση και δείκτη της αγγειογενετικής δραστηριότητας. Η Μοριακή Απεικόνιση (ΜΑ) του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 με τη χρήση ραδιοϊσοτοπικών τεχνικών έχει το πλεονέκτημα υψηλής ευαισθησίας ανίχνευσης πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων του ραδιοϊχνηθέτη σε σχέση με τις συμβατικές τεχνικές (x-ray computed tomography (CT) angiography, contrast-enhanced ultrasound και high-resolution magnetic resonance angiography). Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να ερευνήσουμε τις δυνατότητες της ΜΑ με την βοήθεια γ-κάμερας υψηλής διακριτικής ικανότητας και πειραματικού μοντέλου κονίκλου με ίσχαιμο οπίσθιο άκρο. Επιπλέον ένα σημαντικό μέρος της μελέτης αφορούσε την εφαρμογή του πρωτοκόλλου για τη πρόκληση διαβήτη ώστε να γίνει μελέτη της επίδρασης της συγκεκριμένης παθολογίας στην χωρο-χρονική κατανομή της αγγειογένεσης. Προκειμένου να αποδοθεί μία συνολική εκτίμηση του ενδογενούς μηχανισμού αποκατάστασης του αγγειακού δικτύου, εφαρμόστηκε Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία για την εκτίμηση της δημιουργίας παράπλευρου δικτύου.
Στη πρώτη φάση της μελέτης, έγινε διερεύνηση του πρωτοκόλλου πρόκλησης διαβήτη δεδομένου ότι η μεθοδολογία παρουσιάζει έλλειψη προτυποποίησης. Παράλληλα εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο ισχαιμίας σε μια ομάδα λευκών κονίκλων Νέας Ζηλανδίας για την διερεύνηση του πρωτοκόλλου ΜΑ. Στην μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά επτά κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας οι οποίοι υπεβλήθησαν σε εμβολισμό της μηριαίας αρτηρίας ενός από τα δύο οπίσθια άκρα για την πρόκληση οξείας ισχαιμίας. Στους κόνικλους έγινε ενδοφλέβια έγχυση του κυκλικού επισημασμένου πεπτιδίου [c RGDfk-His]-99mTc που περιέχει την αλληλουχία τριών αμινοξέων Αργινίνης-Γλυκίνης-Ασπαρτικού οξέος (Arginine-Glycine-Aspartic acid or RGD), μέσω της οποίας δεσμεύεται το πεπτίδιο στο μόριο της ιντεγκρίνης ανβ3. Η απεικόνιση του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 πραγματοποιήθηκε με γ-κάμερα υψηλής διακριτικής ικανότητας την 3η και την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας. Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία πραγματοποιήθηκε την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας.
Τα δεδομένα από την ποσοτικοποίηση των απεικονιστικών δεδομένων, έδειξαν ότι υπάρχει αυξημένη πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στη περιοχή ισχαιμίας σε σχέση με τη περιοχή φυσιολογικής αιμάτωσης του ετερόπλευρου άκρου (16020 ± 2309 έναντι 13139 ± 2493 την 3η ημέρα, p=0.0014 και 21616 ± 2528 έναντι 13362 ± 2529 την 9η ημέρα, p<0.0001, αντίστοιχα). Επιπλέον η πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στα φυσιολογικά άκρα φαίνεται να είναι αυξημένη την 9η ημέρα σε σχέση με την 3η ημέρα (p=0.0112), γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στην σταδιακή συγκέντρωση ενεργοποιημένου ενδοθηλίου και στους φυσιολογικούς ιστούς. Η Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία έδειξε ότι την 9η ημέρα που έγινε η λήψη δεδομένων, το μέσο μήκος αγγείων στα φυσιολογικά άκρα ήταν αρκετά μεγαλύτερο σε σχέση με τα ίσχαιμα άκρα (μέση τιμή 3680 ± 369.8 έναντι 2772 ± 267.7, p< 0.0001, αντίστοιχα).
Η ραδιοϊσοτοπική τεχνική που εφαρμόστηκε για την απεικόνιση του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 στη παρούσα μελέτη, έδειξε ότι υπάρχει αυξημένη πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στη περιοχή ισχαιμίας σε σχέση με τη περιοχή φυσιολογικής αιμάτωσης του ετερόπλευρου άκρου, την 3η ημέρα και την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας. Τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν επίσης ότι το φαινόμενο της αγγειογένεσης κορυφώνεται την 9η ημέρα μετά την πρόκληση ισχαιμίας. Επιπλέον τα δεδομένα από τη Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία την 9η ημέρα, δείχνουν ότι ο ενδογενής μηχανισμός σχηματισμού παράπλευρου δικτύου αν και έχει πυροδοτηθεί δεν έχουν σχηματιστεί ακόμα μεγαλύτερα αγγεία και γι αυτό το λόγο η αρτηριογένεση υπολείπεται της αγγειογένεσης σε αυτή τη φάση.
Για την ολοκλήρωση της μελέτης, εκκρεμεί η απεικόνιση των διαβητικών κονίκλων με ίσχαιμο οπίσθιο άκρο η οποία καθυστέρησε λόγω επιμέρους δυσκολιών στη διαδικασία των πειραμάτων. Η ΜΑ δεικτών της αγγειογένεσης σε άκρο που πάσχει από ισχαιμία παρουσία διαβήτη, δύναται να έχει τεράστια εφαρμογή στην κλινική πράξη για την ιατρική παρακολούθηση του ‘διαβητικού ποδιού’.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7944 |
| Date | 08 August 2014 |
| Creators | Τσιουπινάκη, Κωνσταντία |
| Contributors | Καγκάδης, Γεώργιος, Tsioupinaki, Konstadia, Καγκάδης, Γεώργιος, Νικηφορίδης, Γεώργιος, Λούντος, Γιώργος, Καραμάνος, Νίκος, Πέτσας, Θεόδωρος, Καρναμπατίδης, Δημήτριος, Μπακανδρίτσος, Αριστείδης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | English |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0083 seconds