Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών προσρόφησης
των πρωτεϊνών και η μέτρηση των δυνάμεων απoκόλλησής τους από την επιφάνεια τεχνητών
υλικών. Ως βασικό εργαλείο για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε το Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (AFM), με το οποίο ελήφθησαν εικόνες από δείγματα μέσα σε υδατικό διάλυμα καθώς και καταγράφηκαν οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μορίων με επιφάνειες. Η πρωτεΐνη ινωδογόνο
επιλέχθηκε για τη μελέτη εξαιτίας της σημασίας της για τη βιοσυμβατότητα των βιοϋλικών, καθώς ο πολυμερισμός της σε ινώδες είναι δυνατό να καταλήξει στο σχηματισμό θρόμβων. Ως υποστρώματα
προσρόφησης χρησιμοποιήθηκαν η μίκα και το γυαλί λόγω της απαίτησης λείων επιφανειών για το AFM.
Το πρώτο στάδιο της έρευνας περιελάμβανε την ποσοτικοποίηση της προσρόφησης μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου πάνω σε επιφάνεια μίκας υπό μεταβλητές συνθήκες ιοντικής
ισχύος και pH. Στόχος ήταν η κατανόηση του τρόπου, μέσω του οποίου η κατανομή των
ηλεκτροστατικών φορτίων, τόσο στα πρωτεϊνικά μόρια όσο και στην επιφάνεια, επηρεάζει την
αλληλεπίδρασή τους. Η μελέτη της προσρόφησης με μεμονωμένα πρωτεϊνικά μόρια, αντί του
συνήθους συμπαγούς στρώματος, προτιμήθηκε για να αποφευχθεί η παρεμβολή των πλευρικών
αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων στο τελικό αποτέλεσμα. Έτσι, οι εικόνες, οι οποίες
ελήφθησαν με την τεχνική της ταλαντούμενης ακίδας σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και η
στατιστική ανάλυση της επιφανειακής κάλυψης στις διάφορες συνθήκες διαλύματος έδειξαν ότι η
ισορροπία των απωστικών ηλεκτροστατικών δυνάμεων και των δυνάμεων ενυδάτωσης με τις
ελκτικές van der Waals καθορίζει την έκβαση της προσρόφησης από τα πρώτα στάδιά της, όταν
δηλαδή την επιφάνεια προσεγγίζουν ανεξάρτητα πρωτεϊνικά μόρια.
Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της ιοντικής ισχύος και του pH στην αλληλεπίδραση
ινωδογόνου‐επιφανειών επιχειρήθηκε με μέτρηση της δύναμης έλξης και αποκόλλησης ακίδων του
AFM από δείγματα μίκας. Οι ακίδες είχαν προηγουμένως τροποποιηθεί με μικροσφαιρίδια, στην
επιφάνεια των οποίων είχε προσδεθεί ομοιοπολικά, με κατάλληλη χημική διαδικασία, ένα στρώμα
μορίων ινωδογόνου. Οι καμπύλες προσέγγισης‐απομάκρυνσης, οι οποίες περιγράφηκαν θεωρητικά
με βάση το μοντέλο DLVO, απέδειξαν την ύπαρξη συσχέτισης ανάμεσα στις μετρούμενες δυνάμεις και το βαθμό προσρόφησης στις διάφορες συνθήκες. Ειδικότερα οι μετρήσεις σε pH 3.5 έδωσαν
ισχυρές ενδείξεις για αλλαγές της μοριακής διάταξης του ινωδογόνου, οι οποίες μπορούν να
συσχετιστούν με τις ενζυμικά καταλυόμενες αναδιατάξεις της δομής του κατά το σχηματισμό του
ινώδους.
Η τελευταία ομάδα των πειραμάτων επικεντρώθηκε στη μέτρηση της δύναμης αποκόλλησης
μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου από την επιφάνεια γυαλιού. Για το σκοπό αυτό η πρωτεΐνη
προσδέθηκε ομοιοπολικά στις ακίδες του AFM μέσω αλυσίδων πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG),
αφού πρώτα εξετάστηκαν τρεις διαφορετικές τεχνικές επιφανειακής χημικής τροποποίησης (3‐
αμινοπροπυλο‐τριαιθοξυσιλάνιο, αιθανολαμίνη και 3‐αμινοπροπυλο‐διμεθυλ‐αιθοξυσιλάνιο). Ο
εντοπισμός στο σύνολο των καμπύλων, που συλλέχθηκαν, εκείνων, οι οποίες αντιπροσωπεύουν
αποκόλληση ενός μόνο πρωτεϊνικού μορίου, στηρίχθηκε στα χαρακτηριστικά των καμπύλων
τάνυσης των ανεξάρτητων μορίων ινωδογόνου, οι οποίες και προσαρμόστηκαν από το μοντέλο
“Worm‐Like Chain”. Η επεξεργασία των πειραματικών καμπύλων και ο προσδιορισμός της δύναμης
αποκόλλησης σε κάθε μία έγινε με τη βοήθεια πρωτότυπου κώδικα στη Matlab. Οι μετρηθείσες
δυνάμεις ομαδοποιήθηκαν με κριτήριο την ταχύτητα αποκόλλησης και εξετάστηκε κατά πόσο η
θεωρία των Bell και Evans μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την περιγραφή της δυναμικής των δεσμών,
οι οποίοι σχηματίζονται μεταξύ του ινωδογόνου και του υποστρώματος του γυαλιού. Τέλος,
προτάθηκαν δύο θεωρήσεις για τη φυσική ερμηνεία των πειραματικών καμπύλων, οι οποίες
παρουσίαζαν πολλαπλά συμβάντα αποκόλλησης, η θεώρηση της διαδοχικής διάσπασης δεσμών
μιας μοναδικής πρωτεϊνικής αλυσίδας με το υπόστρωμα και η θεώρηση των παράλληλων μορίων.
Συμπερασματικά η διατριβή αυτή παρουσιάζει ολοκληρωμένα τη χρήση του AFM για τη
μελέτη, στο νανοεπίπεδο, της συμπεριφοράς ανεξάρτητων πρωτεϊνικών μορίων σε διεπιφάνειες. Η
πρωτοτυπία της έγκειται στη μέτρηση της δύναμης αποκόλλησης μεμονωμένων μορίων
ινωδογόνου από την επιφάνεια. Η επέκταση της τεχνικής αυτής σε χημικά τροποποιημένες και
σαφώς χαρακτηρισμένες επιφάνειες καθώς και χρήση άλλων πρωτεϊνών μπορεί να φέρει την
τεχνική αυτή κοντά σε ακριβέστερες εφαρμογές ελέγχου της βιοσυμβατότητας
χρησιμοποιούμενων από την ιατρική υλικών. / The aim of this doctoral thesis was the study of the mechanisms of protein adsorption and
the measurement of the detachment forces of proteins from surfaces. The experiments were
conducted with the Atomic Force Microscope (AFM), with which images of adsorbed proteins were
obtained in liquid and protein‐surface interaction forces were recorded. The study was focused on
fibrinogen, a protein the behavior of which on biomaterial surfaces is critical for their
biocompatibility assessment, since its polymerization into fibrin leads to the formation clots. Mica
and glass were used as substrates for adsorption due to the restrictions imposed by AFM techniques
for smooth surfaces.
In the first set of experiments we tried to quantify the adsorption of single protein molecules
on mica at different conditions of pH and ionic strength. The objective was to clarify the role of
electrostatic charge distribution both on the surface and the molecules upon their interaction. Single
protein molecules were studied instead of confluent monolayers in order to exclude the effect of
lateral intermolecular interactions in the measurements. The images acquired with tapping mode in
phosphate buffered saline and the statistical analysis of the surface coverage at the various
conditions indicated that the balance between the repulsive electrostatic or hydration forces and the
attractive van der Waals forces determines adsorption from its very early steps, when individual
molecules approach the surface.
To further investigate the pH and ionic strength effect in fibrinogen‐surface interaction, the
force of attraction and detachment of colloid probes from mica surface was measured. The probes
were constructed from silica microspheres attached to AFM cantilevers and were modified with a
fibrinogen layer covalently bound to their surface. The approach‐retract curves, which were fitted by
the DLVO model, proved that the measured interaction forces, can be correlated with the degree of
adsorption at the various conditions. Particularly measurements at pH 3.5 offered evidence of
fibrinogen conformational changes, which may be related to enzymically catalyzed restructurings
during the formation of fibrin.
The last set of experiments was focused on the measurement of the detachment force of
single fibrinogen molecules from glass surfaces. For this purpose the protein was covalently bound to
AFM tips, through polyethylene glycol linkers, after three different methods of surface chemical modification had been tested (3‐aminopropyl(triethoxysilane), ethanolamine, 3‐
aminopropyl(dimethylethoxysilane)). The experimental curves representing single molecule
detachment were identified from the characteristic stretching curves of the protein chains which
were fitted by the Worm‐Like Chain model. For the automatic processing of force data an algorithm
was written in Matlab. Then the measured rupture forces were grouped according to the loading
rate and an attempt was made to describe the dynamics of fibrinogen‐substrate bindings with the
Bell‐Evans theory. Finally, two models were suggested for the physical interpretation of curves with
multiple rupture events. The first refers to successive ruptures of multiple connections of a single
fibrinogen molecule with the substrate, while the second to parallel molecules stretched between
the tip and the substrate.
In conclusion this thesis demonstrated in detail the use of AFM for the study, at the
nanoscale, of protein molecules at interfaces. An important novelty was the measurement of the
rupture force of single protein molecules from surfaces. Extension of the tested techniques to
chemically modified and well‐characterized surfaces as well as to different proteins can be applied
for the accurate prediction of realistic biomaterial biocompatibility.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/993 |
| Date | 10 October 2008 |
| Creators | Τσαπικούνη, Θεοδώρα |
| Contributors | Μισιρλής, Ιωάννης, Tsapikouni, Theodora, Αντιμισιάρη, Σοφία, Δεληγιάννη, Δέσποινα, Λογοθετίδης, Στέργιος, Μαυρίλας, Δημοσθένης, Μισιρλής, Ιωάννης, Παπανικολάου, Γεώργιος, Τοπρακτσιόγλου, Χρήστος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0029 seconds