Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος της έλικας h44 του 18S rRNA του Saccharomyces cerevisiae επί διαφόρων παραμέτρων της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η μελέτη διεξήχθη με την βοήθεια των σημειακών μεταλλάξεων A1491G (rdn15) και U1495C (rdnhyg1), οι οποίες εντοπίζονται στην Α-θέση του ριβοσώματος. Η μετάλλαξη rdn15 επιδρά ήπια στον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων ενώ τα rdn15 ριβοσώματα επιτελούν την πρωτεϊνοσύνθεση με αυξημένη ακρίβεια. Η έλλειψη σοβαρών επιπτώσεων παρουσία της rdn15 φανερώνει ότι το νουκλεοτίδιο 1491 δεν παίζει καθοριστικό ρόλο στην λειτουργία του ριβοσώματος. Τα κύτταρα ζύμης που φέρουν την μετάλλαξη rdnhyg1 αναπτύσσονται βραδύτερα από τα κύτταρα αγρίου τύπου, ενώ τα rdnhyg1 ριβοσώματα πρωτεϊνοσυνθέτουν με ελαφρώς αυξημένη συχνότητα λάθους. Η μετάλλαξη αυξάνει επίσης την συγγένεια της Α-θέσης του ριβοσώματος για το αμινοακυλο-tRNA και επιδρά αρνητικά στο στάδιο της μετατόπισης, χωρίς να επηρεάζει την ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η επίδραση της μετάλλαξης rdnhyg1 επί διαφόρων παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης δικαιολογεί την συντήρηση της U1495 κατά την εξέλιξη.
Η μετάλλαξη sup45-R2ts εντοπίζεται στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον παράγοντα τερματισμού eRF1 και οδηγεί στην αντικατάσταση της προλίνης 86 από αλανίνη. Η μετάλλαξη δεν επηρεάζει τις περισσότερες από τις λειτουργίες του ριβοσώματος που εξετάστηκαν, αλλά μειώνει την μεταφραστική πιστότητα. Σε κύτταρα που φέρουν ταυτόχρονα την μετάλλαξη sup45-R2ts και την ριβοσωματική μετάλλαξη rdn15, η συχνότητα λάθους αυξάνεται σε βαθμό μεγαλύτερο από την αθροιστική επίδραση των δύο επιμέρους μεταλλάξεων, επιβεβαιώνοντας μια ιδιαίτερη αλληλεπίδραση του μεταλλαγμένου παράγοντα eRF1 με τα rdn15 ριβοσώματα, που, όπως προκύπτει, αντιστρέφει τον υπερακριβή χαρακτήρα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων. Όταν η μετάλλαξη sup45-R2ts συνυπάρχει με την ριβοσωματική μετάλλαξη rdnhyg1 η συχνότητα λάθους δεν επηρεάζεται σημαντικά. Η rdnhyg1 φαίνεται να ελαχιστοποιεί την επίδραση του μεταλλαγμένου παράγοντα eRF1 ενισχύοντας την δράση GTPάσης του eRF3. Τα παραπάνω αποτελέσματα φανερώνουν επιπλέον ότι η sup45 δύναται να μεταβάλει τις ιδιότητας ορισμένων μεταλλάξεων κατά την ριβοσωματική λειτουργία.
Το στέλεχος που φέρει την μετάλλαξη rdn15 είναι πολύ ευαίσθητο έναντι της παρομομυκίνης αλλά και έναντι της τομπραμυκίνης, αν και σε μικρότερο βαθμό. Τα αποτελέσματα αυτά αποδίδονται στην ικανότητα της μετάλλαξης να αυξάνει την συγγένεια της Α-θέσης του ριβοσώματος για τα εν λόγω αντιβιοτικά. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn15 προσδίδει ανθεκτικότητα στην υγρομυκίνη, φανερώνοντας ότι ο τρόπος πρόσδεσης και δράσης του συγκεκριμένου αμινογλυκοζίτη διαφοροποιείται. Το στέλεχος που φέρει την μετάλλαξη rdnhyg1 είναι ανθεκτικό και στα τρία αντιβιοτικά σε σύγκριση με το αγρίου τύπου, φανερώνοντας ότι η U1495 είναι καθοριστική για την πρόσδεση των αμινογλυκοζιτών στο ριβόσωμα. Τα κύτταρα που φέρουν την εξωριβοσωματική μετάλλαξη sup45-R2ts είναι πιο ευαίσθητα από τα αντίστοιχα αγρίου τύπου έναντι και των τριών αμινογλυκοζιτών. Ωστόσο η μετάλλαξη sup45-R2ts, δεν επηρεάζει την ικανότητα των αντιβιοτικών αυτών να προσδένονται στα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα ριβοσώματα και να επάγουν άμεσα τα μεταφραστικά λάθη.
Η μελέτη επίδρασης των αμινγλυκοζιτών επιβεβαίωσε ότι η παρομομυκίνη και η υγρομυκίνη αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων ζύμης, ενώ η τομπραμυκίνη δεν έχει καμία επίδραση. Το γεγονός αυτό συνδυάζεται με την αδυναμία της τομπραμυκίνης να αναστείλει την πρόσδεση του υποστρώματος στην Α-θέση των ριβοσωμάτων. Ωστόσο η τομπραμυκίνη, όπως η παρομομυκίνη και η υγρομυκίνη, είναι ικανή να αυξήσει την συχνότητα λάθους και την σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. / In present study, we investigated the role of helix h44 of 18S rRNA of Saccharomyces cerevisiae on several parameters of protein synthesis. For this purpose we employed mutations A1491G (rdn15) and U1495C (rdnhyg1) which are located in the A-site of the ribosome. The rdn15 mutation slightly delays cell growth, while rdn15 ribosomes translate proteins with higher fidelity. The lack of severe impairment of ribosomal function by mutation rdn15 indicates that the nature of nucleotide 1491 is not essential for ribosomal function. Yeast cells carrying the rdnhyg1 mutation grow slower than wild-type cells, while their ribosomes possess a slightly increased error rate. This mutation also increases the affinity of the A-site for aminoacyl-tRNA and renders ribosomes less efficient in translocation without affecting peptidyltransferase activity. The effect of mutation rdnhyg1 on several parameters of protein synthesis explains why U1495 is evolutionarily conserved.
Mutation sup45-R2ts is located in the gene encoding eukaryotic Release Factor 1 (eRF1) and results in the substitution of proline 86 by alanine. This mutation leaves unaffected most ribosomal functions but it decreases translational fidelity. When ribosomal mutation rdn15 is introduced in cells already carrying sup45-R2ts mutation, the error frequency is increased to a degree which is higher than the additive effect of the two mutations, testifying to a previously reported special interaction of eRF1 with rdn15 ribosomes, which in this case reverses the hyperaccurate character of rdn15 ribosomes. When mutation sup45-R2ts is expressed in cells also carrying ribosomal mutation rdnhyg1, the error frequency is not significantly altered. Mutation rdnhyg1 seems to minimize the effect of the mutant factor eRF1 on ribosomal function by enhancing GTPase activity of eRF3. The results obtained with rdn15 and rdnhyg1 alone or in combination with sup45-R2ts show for the first time that the presence of sup45 may result in significant changes in the properties of the mutations under study.
The strain carrying mutation rdn15 exhibits extremely high sensitivity toward paromomycin and also increases sensitivity of yeast ribosomes to tobramycin but to a lesser degree. These results demonstrate the ability of this mutation to increase affinity of the A-site for aminoglycosides. In contrast, mutation rdn15 causes resistance to hygromycin, revealing that binding and possibly action of hygromycin is differentiated from the other two aminoglycosides. The strain carrying mutation rdnhyg1 is resistant to all three antibiotics tested compared to wild type, indicating that U1495 participates in aminoglycoside binding to the ribosome. Cells carrying the extraribosomal mutation sup45-R2ts are more sensitive toward all three antibiotics compared to their wild type cells. Nevertheless, mutation sup45-R2ts does not affect the ability of these antibiotics to bind to the ribosome and directly induce translational errors.
The study of amingolycoside action confirmed that paromomycin and hygromycin inhibit cells growth, while no such effect is observed during cell growth in the presence of tobramycin. This fact is combined with the inability of tobramycin to inhibit substrate binding to the ribosomal A-site Nevertheless, it was shown that tobramycin, like paromomycin and hygromycin, is effective both in inducing translational errors and increasing polyphenylalanine synthesis in wild-type and mutant ribosomes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/786 |
| Date | 01 July 2008 |
| Creators | Τσέλικα, Σμαραγδή |
| Contributors | Συνετός, Διονύσιος, Tselika, Smaragdi, Συνετός, Διονύσιος, Καλπαξής, Δημήτριος, Λυγερού, Ζωή, Δραΐνας, Διονύσιος, Καραμάνος, Νικόλαος, Μουζάκη, Αναστασία, Γεωργίου, Χρήστος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0023 seconds