La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden progresivo del movimiento
y es la segunda enfermedad relacionada con la edad más común, luego de la
enfermedad de Alzheimer. Se la considera como un desorden multifactorial y
complejo que involucra tanto factores epidemiológicos como genéticos y
toxicológicos, y cuya principal característica es la pérdida progresiva de las neuronas
dopaminérgicas. A pesar de los recientes avances que intentan comprender las bases
moleculares de esta patología, el mecanismo exacto que desencadena la
degeneración de las neuronas dopaminérgicas todavía no se conoce. Numerosos
estudios previos destacan dos características comunes de las lesiones de la substancia
nigra pars compacta de los cerebros con PD: i) alteraciones en el contenido de los
metales de transición y, en consecuencia, aumento del estrés oxidativo (OS) y ii)
sobreexpresión y agregación patológica de la proteína α-sinucleína (α-sin).
El desbalance en los niveles de los metales de transición ha sido reportado
como uno de los principales factores que contribuyen a la degeneración de las
neuronas dopaminérgicas en la PD. Específicamente, se ha descripto que la
sobrecarga de hierro (Fe) y la desregulación de los niveles de cobre (Cu) estarían
involucradas en el daño de las neuronas dopaminérgicas en esta patología. En la
primera parte de este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue caracterizar los
mecanismos de reparación de membrana mediante el estudio de las reacciones de
acilación y deacilación y su rol en la injuria oxidativa en la neuronas dopaminérgicas
N27 expuestas a sobrecarga de Fe y suplementación con Cu.
Las neuronas N27 incubadas en presencia de Fe2+ (1 mM) por 24 hs
mostraron elevados niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), peroxidación
lipídica y aumentada permeabilidad de membrana plasmática. Por otro lado, en las
neuronas que fueron suplementadas con Cu2+ (10,50 μM) no se observaron
alteraciones en los marcadores de OS. Se observó un perfil de acilación diferencial en las neuronas N27 premarcadas con [3H]ácido araquidónico (AA) o [3H]ácido oleico (OA). En las
neuronas expuestas a Fe2+, la incorporación de AA aumentó en la fracción de
triacilglicéridos (TAG), mientras que su incorporación en la fracción de fosfolípidos
(PL) se vio disminuida. El contenido de TAG resultó más elevado (40 %) en las
neuronas expuestas a Fe2+ que en los controles. Este aumento fue acompañado por
la aparición de cuerpos lipídicos Nile Red positivos. En contraposición, la
incorporación de OA se vio incrementada en la fracción de PL y no mostró cambios
en los TAG. El perfil de acilación lipídica en las neuronas que fueron suplementadas con
Cu mostró una mayor acumulación de AA en el PL fosfatidilserina y ningún cambio
con respecto a su incorporación en TAG. La inhibición de las reacciones de
acilación/deacilación desencadenaron un aumento en los niveles de los marcadores
de OS y disfuncionalidad mitocondrial en las neuronas expuestas a sobrecarga de
Fe2+. Estos hallazgos brindan evidencia acerca de la participación de los mecanismos
de acilación frente a la injuria oxidativa inducida por Fe2+ y postulan que las
neuronas dopaminérgicas preservan, inteligentemente, el AA en los TAG en
respuesta al OS. Como se mencionó anteriormente, la sobreexpresión patológica de la α-sin
está involucrada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la PD. En la
segunda parte de este trabajo, caracterizamos el rol de dos variantes de la α-sin, WT
(en su forma nativa) y A53T (una mutación que se encuentra en la PD familiar de
aparición temprana), durante el OS inducido por Fe2+ y estudiamos como el
metabolismo lipídico estaría involucrado en el destino neuronal. Para ello,
utilizamos la línea celular neuronal dopaminérgica N27 sin transfectar (UT) y dos
líneas celulares N27 transfectadas de forma estable con WT-α-sin (WT) o A53T-α-sin
(A53T). Estas células fueron expuestas a daño inducido por Fe2+ y luego, se
analizaron los marcadores de OS y el estado del metabolismo lipídico.
Dependiendo del tipo de α-sin expresado, se obtuvieron distintas respuestas
neuronales a la sobrecarga de Fe2+. Las células A53T expuestas a injuria inducida por
Fe2+ mostraron menores niveles de ROS y menor alteración en la permeabilidad de
la membrana plasmática respecto a las neuronas WT. La presencia de A53T-α-sin
provocó un aumento en el contenido de TAG, el cual fue aún mayor luego de la
exposición de las neuronas a sobrecarga de Fe2+. Por otro lado, las neuronas WT no
mostraron alteraciones en el contenido de TAG, respecto a las células UT.
Las neuronas A53T también presentaron un aumento en la expresión de la
sintasa de ácidos grasos (FAS), junto con una mayor resistencia a la cerulenina, un
potente inhibidor de la FAS. El contenido de PL y colesterol (Chol) fue similar en las
neuronas UT, WT y A53T. La inhibición farmacológica de la síntesis de novo de los TAG provocó un
aumento en la muerte celular de las células A53T durante el daño inducido por Fe2+
mientras que la inhibición de los mecanismos de acilación/deacilación no afectaron
ni el contenido de TAG ni la viabilidad celular en la medida en que se afectaron
estos parámetros en las células UT. Nuestros resultados brindan nueva evidencia
acerca del rol diferencial de las variantes de α-sin en el metabolismo lipídico
neuronal, que está relacionado a la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe2+.
En conclusión, hemos demostrado que la respuesta neuronal al daño
oxidativo y a la sobreexpresión de A53T-α-sin, es dependiente de los mecanismos
de acilación/deacilación lipídica e involucra acumulación de TAG. Aunque la
inhibición de la síntesis de TAG en las neuronas A53T promueva la muerte celular,
nuestros resultados sugieren que la aparición de TAG, algo inusual para el fenotipo
neuronal, podría constituir un marcador temprano de daño neuronal. / Parkinson’s disease (PD) is a progressive movement disorder and is the
second most common age-related neurodegenerative illness after Alzheimer’s
disease. PD is a multifactorial and complex disorder including epidemiological,
genetic and toxicological factors whose main characteristic is the progressive loss of
dopaminergic neurons. Despite all the effort to understand the molecular basis of
this pathology, the exact molecular mechanism that triggers the degeneration of
dopaminergic neurons remains still unknown. Cumulative evidence highlights two
common facts that occur in the substantia nigra pars compacta lesions in the brain of
PD patients: i) alterations in transition metal content and, in consequence, increased
oxidative stress (OS) and ii) overexpression and pathological aggregation of the
protein α-synuclein (α-syn).
Metal-imbalance has been reported as one of the main contributing factor for
the degeneration of dopaminergic neurons in PD. Specifically, iron (Fe) overload
and copper (Cu) mis-compartmentalization have been reported to be involved in
the injury of dopaminergic neurons in this pathology. In the first part of this work,
our aim was to characterize the mechanisms of membrane repair by studying lipid
acylation and deacylation reactions and their role in oxidative injury in N27
dopaminergic neurons exposed to Fe-overload and Cu-supplementation.
N27 dopaminergic neurons incubated with Fe2+ (1 mM) for 24 hs displayed
increased levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and elevated
plasma membrane permeability. Cu2+-supplemented neurons (10, 50 μM) showed
no evidence of OS markers.
A different lipid acylation profile was observed in N27 neurons pre-labeled
with [3H]arachidonic acid (AA) or [3H]oleic acid (OA). In Fe-exposed neurons, AA
uptake was increased in triacylglycerols (TAG) whereas its incorporation into the
phospholipid (PL) fraction was diminished. TAG content was 40 % higher in Feexposed
neurons than in controls. This increase was accompanied by the
appearance of Nile red positive lipid bodies. Contrariwise, OA incorporation
increased in the PL fractions and showed no changes in TAG. Lipid acylation profile
in Cu-supplemented neurons showed AA accumulation into phosphatidylserine and
no changes in TAG. The inhibition of deacylation/acylation reactions prompted an
increase in OS markers and mitochondrial dysfunction in Fe-overloaded neurons.
These findings provide evidence about the participation of lipid acylation
mechanisms against Fe-induced oxidative injury and postulate that dopaminergic
neurons cleverly preserve AA in TAG in response to OS.
As previously mentioned, pathological α-syn overexpression is involved in
the death of dopaminergic neurons in PD. In the second part of this work, we
characterized the role of α-syn variants, Wild Type (WT) and A53T (a dominant
mutation found in familial early onset PD) during Fe-induced OS and investigated
whether lipid metabolism has implications for neuronal fate. To this end, we used
the N27 dopaminergic neuronal cell line non-transfected (UT) and two stably
transfected N27 cell lines with WT α-syn (WT) or mutated A53T α-syn (A53T). Cells
were exposed to Fe-induced injury and OS markers and the status of lipid
metabolism were analyzed.
Neuronal response to Fe-induced overload is dependent on the type of α-syn
expressed. A53T cells exposed to Fe-induced injury showed lower ROS levels and
diminished plasma membrane permeability alteration than WT neurons. The
presence of A53T α-syn promoted an increase in TAG content that was enhanced
during Fe-induced OS. On the contrary, WT neurons did not display changes in
TAG levels with respect to UT cells. A53T neurons also exhibited an increase in fatty
acid synthase (FAS) expression, and higher resistance to the potent FAS inhibitor
cerulenin. PL and cholesterol (Chol) content were similar in UT, WT and A53T
neurons. Pharmacological inhibition of de novo synthesis of TAG increased A53T cell
death during Fe-induced injury whereas the blockage of PL and Chol
acylation/deacylation affected neither TAG content nor cell viability to the same
extent as that observed in UT neurons. Our results bring new evidence about a
differential role of α-syn variants on neuronal lipid metabolism that is related to the
neuronal response to Fe-overload.
In conclusion, we have demonstrated that the neuronal response to OS injury and
A53T α-syn overexpression is dependent on lipid acylation and deacylation
mechanisms and also involves TAG accumulation. Even though the inhibition of
TAG synthesis in A53T neurons promoted cell death, our findings suggest that TAG
appearance, rather unusual for the neuronal phenotype, could constitute an early
marker of neuronal injury.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/3332 |
| Date | 09 March 2017 |
| Creators | Sánchez Campos, Sofía |
| Contributors | Salvador, Gabriela Alejandra |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 2 |
Page generated in 0.0037 seconds