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Previous issue date: 2016-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In the last decades the search for new renewable energy sources have increased and one of
the emerged technologies was the production of ethanol from lignocellulosic biomass (second
generation ethanol). For obtaining fermentable sugars from biomass, a complex of enzymes
and proteins that acts on polysaccharides of the plant cell wall is required. Expansins are
proteins that can help enzymes in the degradation process, promoting the loosening of the
cell wall of plants by breaking hydrogen bonds between cellulose fibers and hemicellulose. The
superfamily of expansins has been described mainly in plants, although they are also found in
fungi and bacteria. Four families are described to this superfamily: α-expansins, β-expansins,
expansins-like A and expansins-like B. The α-expansins are present in most eudicots, whereas
the β-expansins are involved in cellular expansion process of the monocots family Poaceae. To
analyze the sequence and to verify the functional activity of a β-expansin on filter paper, in
this work a gene of β-expansin (expb11) of sugarcane was isolated, cloned and expressed in
the yeast Pichia pastoris. Nucleotide sequences of expansin genes from sugarcane were
initially obtained from the public SUCEST database using reference sequences of expansins
from sorghum, maize and rice as query. A total of 227 ESTs were identified. These ESTs were
submitted to clustering and 30 contigs and 92 singletons were obtained. Specific oligos were
designed and used to capture the genomic fragment corresponding to the expb11 gene by
PCR. The coding DNA fragment of expb11 was obtained by RT-PCR from the total RNA
extracted from stalks of the RB867515 sugarcane cultivar. This fragment was cloned into the
pGEM-T Easy vector and subcloned into the pPIC9 vector. Genomic and cDNA fragments were
sequenced. The expression cassette generated by subcloning into the pPIC9 expression vector
was integrated into the P. pastoris strain GS115 genome, but it has not been possible to
detect a functional activity of expansin. The expb11 gene comprises 1367 bp, containing 3
introns, and its cDNA is 801 bp long, with an ORF of 776 bp. The alignment of sugarcane and
sorghum sequences of expb11 showed that the two species share a 95% sequence identity
along these genes and that the gene structure is highly conserved in these species. The in
silico analysis of the putative EXPB11 amino acid sequence allowed the detection of two
conserved domains, one similar to the GH45 family, and the other to the carbohydrate binding
module (CBM). The putative EXPB11 protein has a predicted molecular weight of
approximately 26.4 kDa, an isoelectric point (pI) of 4.88, and contains two glycosylation sites.
Our results confirmed that the isolated and cloned expb11 gene corresponds to a β-expansin
gene from sugarcane, paving the way to the expression, isolation and use of recombinant
EXPB11 in the mix of enzymes and proteins for lignocellulosic biomass degradation. / Nos últimos anos tem crescido a busca por novas fontes de energia renováveis, e uma das
tecnologias utilizadas é a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (etanol de
segunda geração). Para a obtenção de açúcares fermentáveis a partir dessa biomassa, é
necessário um complexo de enzimas e proteínas que atuarão sobre os polissacarídeos da
parede celular vegetal. As expansinas são proteínas que podem auxiliar as enzimas no
processo de degradação, promovendo o afrouxamento da parede celular das plantas pelo
rompimento de ligações de hidrogênio entre fibras de celulose e hemicelulose. A superfamília
das expansinas foi descrita principalmente em plantas, entretanto, há relatos em fungos e
bactérias. São descritas 4 famílias de expansinas: α-expansinas, β-expansinas, expansinas
like-A e expansinas like-B. As α e β-expansinas já são caracterizadas, desempenhando
importante função no crescimento vegetal. As α-expansinas são mais presentes em plantas
dicotiledôneas, enquanto que as β-expansinas estão envolvidas no processo de expansão
celular de monocotiledôneas da família Poaceae. Para analisar a sequência e verificar a
atividade funcional de uma β-expansina sobre bagaço de cana-de-açúcar, neste trabalho foi
isolado, clonado e expresso um gene de β-expansina (expb11) de cana-de-açúcar na levedura
Pichia pastoris. A sequência de nucleotídeos do gene de β-expansina da cana-de-açúcar foi
obtida a partir da biblioteca de cDNA de cana-de-açúcar do projeto SUCEST. Sequências de
referências de expansinas de sorgo, milho e arroz foram utilizadas para identificar ESTs de
expansinas no banco de dados SUCEST. Foram identificadas 227 ESTs. Essas ESTs foram
submetidas à clusterização e foram obtidos 30 contigs e 92 singletons. Após o desenho de
oligonucleotídeos, o fragmento genômico correspondente ao gene expb11 foi amplificado por
PCR. A região codante do gene expb11 foi obtida por RT-PCR a partir de RNA total obtido de
colmo da cultivar RB867515. Esse material foi clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado no
vetor pPIC9. Os fragmentos genômico e cDNA obtidos foram analisados por sequenciamento.
O cassete de expressão gerado pela subclonagem em vetor de expressão pPIC9 foi integrado
no genoma de P. pastoris linhagem GS115, mas não foi possível detectar atividade funcional
da expansina. O gene expb11 possui 1367 pb, contendo 3 íntrons, enquanto o cDNA 801 pb.
Pelo alinhamento das sequências genômicas do gene expb11 obtidas de cana-de-açúcar e de
sorgo, foi possível se observar que estes genes possuem 95 % de identidade, e estrutura de
íntrons/éxons semelhantes. Pela análise in silico da sequência de aminoácidos da proteína
EXPB11 foi possível verificar que ela possui dois domínios, um similar ao da família GH45, e
outro similar ao módulo de ligação ao carboidrato (CBM). A proteína EXPB11 possui peso
molecular de aproximadamente 26,4 kDa, pI 4,88, e contém dois sítios de glicosilação. Os
resultados obtidos através das análises in silico mostraram que o gene expb11, isolado e
clonado, corresponde a um gene de β-expansina de cana-de-açúcar, e ao ser produzida, a
EXPB11 recombinante poderá integrar o mix de enzimas e proteínas para a degradação de
biomassa lignocelulósica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/7365 |
| Date | 31 August 2016 |
| Creators | Costa, Ilítia Ganaê de Oliveira |
| Contributors | Coelho, Alexandre Siqueira Guedes, Faria, Fabrícia Paula de, Coelho, Alexandre Siqueira Guedes, Silva, Silvana Petrofeza, Georg, Raphaela de Castro, Siqueira, Saulo José Linhares, Colussi, Francieli |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento de Plantas (EAEA), UFG, Brasil, Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos - EAEA (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3325099404361873119, 600, 600, 600, 600, 4500684695727928426, -7397920248419280716, 2075167498588264571 |
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