Τα τελευταία χρόνια πολλές ερευνητικές ομάδες εστίασαν στην ταυτοποίηση
γονιδίων που ενέχονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες και η Δροσόφιλα
αποτέλεσε τον ιδανικό οργανισμό-μοντέλο λόγω της διαθεσιμότητας πολλών
γενετικών εργαλείων. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής ευνόησε
ιδιαίτερα την ευρείας κλίμακας γενετική ανάλυση στη Δροσόφιλα. Εκμεταλλευόμενοι
τα διαθέσιμα εργαλεία πραγματοποιήσαμε μία μελέτη σάρωσης βασισμένη σε RNAi
για γονίδια που εμπλέκονται στη μορφογένεση του συστήματος των σωματικών μυών
και του επιθηλίου του φτερού της Drosophila melanogaster. Συνολικά, εξετάσαμε
321 γονίδια με συστημική ή ιστοειδική RNAi σιώπηση στο μεσόδερμα ή με
συνδυασμό και των δύο και ταυτοποιήσαμε 58 γονίδια άγνωστης λειτουργίας τα
οποία χρειάζονται για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του εμβρυϊκού/προνυμφικού
μυϊκού συστήματος. Περιέργως, στις μισές σχεδόν περιπτώσεις δεν παρατηρήσαμε
φαινότυπο θνησιμότητας πλήρους διεισδυτικότητας, γεγονός που υποδεικνύει ότι ο
αριθμός των γονιδίων που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη διεργασία είναι
μεγαλύτερος από αυτόν που έχει προβλεφθεί με βάσει τα αποτελέσματα μίας ευρείας
κλίμακας μελέτης σάρωσης με RNAi στο μυϊκό σύστημα που ολοκληρώθηκε
πρόσφατα. Επιπλέον, μελετήσαμε 242 γονίδια με ιστοειδική σιώπηση στα επιθήλια
και ταυτοποιήσαμε 32, τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα, και 24, τα
οποία είναι αναγκαία για τη μορφοποίηση του ενήλικου φτερού. Από τα γονίδια που
έδωσαν θετικό αποτέλεσμα επιλέξαμε ένα το οποίο είναι απαραίτητο και για τις δύο
διεργασίες, το chd64.
Το chd64 κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που αποτελείται από μία δομική περιοχή
με ομολογία στις καλπονίνες (CH) και ένα μοτίβο CLIK23 και παρουσιάζει 42% και
43% ταυτότητα με τις τρανσγελίνες 2 και 3 των θηλαστικών αντιστοίχως. Οι
τρανσγελίνες συνιστούν μία οικογένεια πρωτεϊνών που εμφανίζουν υψηλό βαθμό
συντήρησης και συμμετέχουν στο σχηματισμό δεσμίδων και στη σταθεροποίηση των
ινιδίων ακτίνης. Το γονιδίωμα της Δροσόφιλας εμπεριέχει τρεις διαφορετικούς
γενετικούς τόπους: CG4694 ή Mp20, CG14996 ή Chd64 and CG5023, σε πλήρη
αναλογία με τα γονιδιώματα των θηλαστικών. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μας
έδειξαν ότι από τα γονίδια που κωδικοποιούν τις τρεις τρανσγελίνες της Δροσόφιλας
μόνο το Chd64 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα και τη σωστή ανάπτυξη των
μυϊκών και επιθηλιακών ιστών. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του γονιδίου ήταναπαραίτητο: α) να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης του και β) να αξιολογήσουμε
τα αποτελέσματα της απώλειας λειτουργίας του σε διαφορετικούς ιστούς. Έτσι,
δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν τυχαίες ενθέσεις ενός γενωμικού
τμήματος του γονιδίου συζευγμένου με GFP που επέτρεπε την παρατήρηση του
ενδογενούς προτύπου έκφρασης του γονιδίου σε ζωντανό οργανισμό κατά τη
διάρκεια της ανάπτυξης. Ταυτόχρονα, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα έναντι
ολόκληρης της πρωτεΐνης Chd64. Επιπλέον, προμηθευτήκαμε δύο UAS:chd64IR
στελέχη και πολλά διαφορετικά GAL4 στελέχη με σκοπό να μελετήσουμε την
επίδραση της μειορρύθμισης του chd64 σε διαφορετικούς ιστούς. Τέλος,
δημιουργήσαμε δύο ελλείψεις που απομακρύνουν το chd64. Τα δεδομένα που έχουμε
ως τώρα δείχνουν ότι το chd64 εκφράζεται έντονα στον εμβρυϊκό/προνυμφικό
πεπτικό σωλήνα, στα αιμοκύτταρα, στην τραχεία, στο νευρικό σύστημα, στα
περιτραχειακά κύτταρα Inka, στους εμβρυϊκούς δίσκους, στους σιελογόνους αδένες,
στην επιδερμίδα και στα τενόντια κύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώσαμε έκφραση του
γονιδίου στα θυλακοκύτταρα και μισχοειδή κύτταρα των ωοθυλακίων. Σε όλους τους
παραπάνω κυτταρικούς τύπους η πρωτεΐνη συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και
στην περιφέρεια του κυττάρου. Λεπτομερέστερη ανάλυση των μεγάλων κυττάρων
των σιελογόνων αδένων έδειξε ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται σε μεβρανικές δομές που
αντιστοιχούν στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο φλοιό του κυττάρου, όπου
συνεντοπίζεται με την ακτίνη. Οι μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι έκφραση
του chd64 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία ή/και
λειτουργικότητα των μαλπιγγιανών σωληναρίων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι η
αναστολή της ζυγωτικής έκφρασης του γονιδίου οδηγεί σε διόγκωση των
μαλπιγγιανών σωληναρίων και σχετίζεται με τη μη φυσιολογική υποκυτταρική
κατανομή της DE-καδερίνης. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης του γονιδίου στην
προαναφερθείσα διαδικασία παραμένει άγνωστος. Η απομάκρυνση της μητρικής
προέλευσης Chd64 πρωτεΐνης και η εκτενέστερη εξέταση της διαδικασίας
καθορισμού και της πολικότητας των κυττάρων που συγκροτούν τα μαλπιγγιανά
σωληνάρια σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο γενετικό υπόβαθρο με τη χρήση
κατάλληλων μαρτύρων θα μας δώσουν νέες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία
του γονίδιου σε ολόκληρο τον οργανισμό. / In the past years many research groups have focused in the identification of
genes that are involved in distinct biological processes and Drosophila has provided
the ideal model-organism due to the availability of several genetic tools. The
introduction of RNAi technology has greatly facilitated the conduction of many large
scale genetic analyses in Drosophila. Taking advantage of the available tools we
conducted an RNAi-based screen for genes involved in the morphogenesis of the
somatic muscle system and wing epithelium of Drosophila melanogaster.
Collectively, we tested 321 genes with either systemic or tissue-specific RNAi
silencing in the mesoderm or a combination of both and discovered 58 novel genes
which are required for proper development and homeostasis of the embryonic/larval
muscular system. Surprisingly, in almost half of the cases we did not observe a lethal
phenotype of complete penetrance arguing that the number of genes involved in the
particular process is greater than the one estimated based on the results of a recently
completed genome-wide scale RNAi-based muscle screen. In addition, we tested 242
genes by tissue-specific gene inactivation in the epithelia and identified 32 that are
required for adult viability and 24 that are indispensible for proper adult wing
morphogenesis. Among our positive hits we selected one that is required for both
processes for further examination, namely chd64.
Chd64 encodes a protein that consists of a calponin-homology (CH) domain
and a CLIK23 motif and exhibits 42% and 43% identity with the mammalian
transgelins 2 and 3 respectively. Transgelins comprise a highly conserved family of
proteins that have been implicated in the bundling and stabilization of actin filaments.
The Drosophila genome bears three distinct loci: CG4694 or Mp20, CG14996 or
Chd64 and CG5023 by complete analogy to the mammalian genomes. Our initial
results showed that out of the three genes that code for the fly transgelins only chd64
is required for viability and the proper development of muscle and epithelial tissues.
In order to gain insight into the function of chd64 it was crucial to: a) explore the
expression pattern of the gene and b) evaluate the effects of chd64 loss of function in
diverse tissues. Thus, we generated transgenic flies that bear random insertions of a
GFP-tagged genomic fragment for the gene that allowed us to visualize the
endogenous gene expression pattern in the living organism throughout development.
Meanwhile, we developed an antibody against the full-length Chd64 protein. Inaddition, we obtained two different UAS:chd64IR strains and many tissue specific
GAL4 strains in order to explore the effects of chd64 knock-down in the specific
tissues. Finally we generated two deletions that remove chd64. Our data so far
indicate that chd64 is largely expressed in the embryonic/larval gut, hemocytes,
trachea, nervous system, peritracheal Inka cells, imaginal discs, salivary glands,
epidermis and tendon cells. In addition, we observed chd64 expression in the follicle
and stalk cells of egg chambers. In all the above mentioned cell types the protein is
accumulated in the cytoplasm and periphery. More detailed analysis using the large
salivary gland cells shows that Chd64 is specifically localized in some membranous
structures of the cytoplasm corresponding to the ER and in the cell cortex where it colocalises
with actin. Our loss of function studies demonstrate that chd64 expression is
indispensable for viability and for the normal morphology and/or function of
malpighian tubules. We specifically observed that the ablation of chd64 zygotic
expression results in the appearance of bloated tubules and is involved in the
abnormal subcellular distribution of DE-cadherin. However the mode of the gene’s
action in the above mentioned procedure remains unknown. Consequently, we
conclude that chd64 exhibits a complicated expression pattern during development
and is required for viability. Removal of the maternally derived Chd64 protein and
further examination of malpighian tubule cell specification and polarity using specific
markers in wild type and mutant backgrounds will provide a novel insight on the
gene’s functions in the whole organism.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6538 |
| Date | 18 December 2013 |
| Creators | Μουρατίδου, Μαρία |
| Contributors | Ζέρβας, Χρήστος, Mouratidou, Maria, Ζέρβας, Χρήστος, Μίντζας, Αναστάσιος, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Μπούρτζης, Κωνσταντίνος, Δελιδάκης, Χρήστος, Κατσώρης, Παναγιώτης, Καπετανάκη, Γιασεμή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0034 seconds