Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο ρόλος στην ευκαρυωτική πρωτεϊνοσύνθεση των μεταλλάξεων rdn15 (A149G), η οποία βρίσκεται στο κέντρο αποκωδικοποίησης του ριβοσώματος του S. cerevisiae και sup45-R2ts, η οποία είναι εξωριβοσωματική και αφορά στην αντικατάσταση της προλίνης από αλανίνη στην θέση 86 του Τομέα 1 του eRF1. Η μελέτη έγινε με τη βοήθεια των αντιβιοτικών εδεΐνης, η οποία είναι ένας αναστολέας της έναρξης της μετάφρασης, και πακταμυκίνης, η οποία είναι ένας αναστολέας της μετατόπισης.
Η μετάλλαξη rdn15 στον S.cerevisiae οδηγεί σε μικρή αύξηση του χρόνου διπλασιασμού των κυττάρων, ενώ επηρέασε μόνο ελαφρώς την πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος. Τα αποτελέσματα αυτά είναι συμβατά με το γεγονός της φυσιολογικής παρουσίας της γουανίνης στη θέση 1491 στους προκαρυώτες και σε κατώτερους ευκαρυώτες. Η παρουσία της μετάλλαξης rdn15 δεν επηρέασε σημαντικά την πιστότητα, αν και η τάση ήταν η απόδοση στα ριβοσώματα ενός ελαφρά υπερακριβούς χαρακτήρα.
Η μετάλλαξη sup45-R2ts στον eRF1 φάνηκε να επιβραδύνει την ανάπτυξη των κυττάρων διπλασιάζοντας σχεδόν τον χρόνο διπλασιασμού τους. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε καταστολή των κωδικίων λήξης αλλά και σε επαγωγή μεταφραστικών λαθών από τον μεταλλαγμένο παράγοντα τερματισμού. Η παρουσία της μετάλλαξης sup45-R2ts in vitro επηρέασε μόνο ελαφρά την πρωτεΐνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος, ενώ αντιθέτως μείωσε σημαντικά τη μεταφραστική πιστότητα, αυξάνοντας τη Συχνότητα Λάθους του ριβοσώματος.
Το αντιβιοτικό εδεΐνη αναστέλλει την ανάπτυξη τόσο των αγρίου τύπου και όσο και των μεταλλαγμένων στελεχών, ενώ όλα τα στελέχη εμφανίζουν όμοια ευαισθησία έναντι της εδεΐνης. Ο S. cerevisiae εμφανίζει παρόμοια ευαισθησία έναντι της εδεΐνης in vivo με αυτήν του E.coli . Αναδεικνύεται έτσι ότι και στο ευκαρυωτικό κύτταρο του S. cerevisiae , οι βάσεις με τις οποίες αλληλεπιδρά η εδεΐνη έχουν τον ίδιο λειτουργικό ρόλο, όπως και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. Η εδεΐνη μειώνει την πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος του S. cerevisiae σε in vitro σύστημα μετάφρασης ελεύθερο κυττάρων, όπου τόσο το αγρίου τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα στελέχη επέδειξαν παρόμοια ευαισθησία στη δράση της εδεΐνης Η έλλειψη διαφοροποίησης ανάμεσα στο αγρίου τύπου και τα μεταλλαγμένα στελέχη, μπορεί να ερμηνευθεί από το γεγονός ότι οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις δεν εμπλέκονται στη διαδικασία της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, που είναι ο κύριος στόχος της εδεΐνης. Η επίδραση της εδεΐνης στη μεταφραστική πιστότητα μετρήθηκε με τη Συχνότητα Λάθους (Σ.Λ.). Η εδεΐνη ελαττώνει την πιστότητα της μετάφρασης στον ίδιο βαθμό περίπου στο ευκαρυωτικό όσο και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα, η δράση της όμως διαφοροποιείται μεταξύ των στελεχών. Το υπερακριβές στέλεχος επέδειξε ελαφρώς μικρότερη ευαισθησία στην επαγωγή μεταφραστικών λαθών από την εδεΐνη σε σχέση με το αγρίου τύπου, ενώ αντιθέτως, το επιρρεπές σε λάθη στέλεχος εμφανίστηκε εξαιρετικά ευαίσθητο στην επαγωγή λαθών από την εδεΐνη σε σχέση με το αγρίου τύπου. Φαίνεται λοιπόν ότι η δράση της εδεΐνης στην πιστότητα ακολουθεί το χαρακτήρα της μετάλλαξης.
Το αντιβιοτικό πακταμυκίνη αναστέλλει την ανάπτυξη in vivo των αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Ο S.cerevisiae εμφανίζει παρόμοια ευαισθησία έναντι της πακταμυκίνης in vivo με αυτήν του E.coli , ενώ οι υπό μελέτη μεταλλάξεις δεν επηρεάζουν την ευαισθησία των κυττάρων έναντι της πακταμυκίνης. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τόσο η rdn15 μετάλλαξη στο κέντρο αποκωδικοποίησης όσο και η sup45-R2ts στον eRF1 δεν παρεμβαίνουν στη διαδικασία της μετατόπισης κατά τη μετάφραση, η αναστολή της οποίας αποτελεί τον κύριο τρόπο δράσης της πακταμυκίνης. Η πακταμυκίνη προκαλεί αναστολή σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης in vitro τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές συγκεντρώσεις σε όλα τα στελέχη. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε αντίθεση με αυτό που ισχύει στο προκαρυωτικό κύτταρο, όπου η πακταμυκίνη διεγείρει τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (Dinos et al., 2004). Η πακταμυκίνη ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στη Συχνότητα Λάθους του στελέχους αγρίου τύπου, ούτε στο υπερακριβές υπόβαθρο του rdn15 και στο επιρρεπές στα λάθη υπόβαθρο του sup45rdnwt. Το αποτέλεσμα αυτό δεν επιβεβαιώνει την υπερακρίβεια που προκαλεί στα προκαρυωτικά αλλά και δεν την αναιρεί.
Η ταυτόχρονη παρουσία των δύο αντιβιοτικών ανέστειλε τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης σε αντίθεση με το πρωκαρυωτικό (Dinos et al., 2004), ακόμη και όταν η πακταμυκίνη χρησιμοποιήθηκε σε μεγάλη περίσσεια επί της εδεΐνης. Η ταυτόχρονη παρουσία των δύο αντιβιοτικών δεν έδειξε να μεταβάλλει το χαρακτήρα της αναστολής. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν υπέρ μιας αθροιστικής δράσης των δύο αντιβιοτικών και αποκλείουν τη συνεργατικότητά τους στη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης από το ευκαρυωτικό ριβόσωμα. Κατά την ταυτόχρονη παρουσία ακόμη και μεγάλης περίσσειας πακταμυκίνης η εδεΐνη εξακολουθεί να προκαλεί αύξηση στη Συχνότητα Λάθους που προσομοιάζει με αυτήν που παρατηρείται κατά την παρουσία εδεΐνης μόνο. Η αλληλεπίδραση των αντιβιοτικών στην πιστότητα της μετάφρασης είναι όμοια με αυτήν που παρατηρείται στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. / In the present study we investigated the role of two mutations, rdn15 and sup45-R2ts, in eukaryotic protein synthesis. The former is substitution A1491G and it is located in the decoding center of the S. cerevisiae ribosome. The latter is extraribosomal and involves the substitution of proline by alanine in position 86 of Domain 1 of eukaryotic release factor eRF1. These strains were then employed for the study of the mode of action of two antibiotics, edeine and pactamycin, in eukaryotic protein synthesis. In bacterial cells, edeine has been characterized as an inhibitor of translation initiation, whereas pactamycin was recently found to act as a translocation inhibitor.
Mutation rdn15 leads to a slight increase of doubling times but it has no significant effect on translational fidelity although there was a slight increase of the latter indicated by slightly lower error frequencies. It should be noted that guanine is naturally present in position 1491 of prokaryotic 16S rRNA. Thus, the lack of severe impairment of ribosomal function by mutation rdn15 shows that the nature of nucleotide 1491 is not essential for ribosomal function but may be useful in the fine tuning of ribosomal activity.
Omnipotent suppressor mutation sup45-R2ts in eRF1 leads to a significant increase of doubling times, almost by a factor of 2 compared to the wild type strain. This might be a result of the suppression of nonsense codons or, in our case, an increase in misincorporation of amino acids during elongation. The presence of the sup45-R2ts mutation affected marginally the synthesis of polyphenylalanine in vitro. On the contrary, it remarkably reduced translational fidelity, increasing the Error Frequency.
Edeine inhibits the growth of the wild type as well as the mutant strains. All strains exhibited similar sensitivity towards edeine. Moreover, this sensitivity of S. cerevisiae cells towards edeine is similar to the sensitivity of E. coli cells towards edeine. This could indicate that the RNA bases of the yeast ribosome, with which edeine interacts, have a similar functional role as in the prokaryotic one. Edeine reduces the amount polyphenylalanine synthesis in a cell-free in vitro system and it was found that all the strains exhibit the same sensitivity towards edeine. The lack of effect may be attributed to the fact that these mutations are not involved in the initiation of translation, which is the primary target of edeine. The effect of edeine in the translational fidelity was estimated by the error frequency. Edeine highly reduces translational fidelity in the eucaryotic ribosome, almost as much as in the prokaryotic one, but differentially between the wild type strain of S. cerevisiae and the mutant strains. The hyperaccurate strain exhibited less translational errors in the presence of edeine in comparison to the wild type strain. On the contrary, the error prone strain was very sensitive and displayed a very high translational error rate. It appears that the effect of edeine in fidelity is in line with the character of the mutation.
Pactamycin suppressed the growth of both the wild type and the mutant strains in vivo. S. cerevisiae exhibits a similar sensitivity as E. coli in the effect of pactamycin in vivo, whereas the mutations under study did not affect the sensitivity of the cells. This could be attributed to the fact that mutation rdn15 in the decoding center and sup45-R2ts in eRF1 do not affect translocation during translation, which is the primary target of pactamycin. Pactamycin, both at low and high concentrations, suppresses the synthesis of polyphenylalanine in vitro in all the strains under study. This result is in contrast with the effect of pactamycin in the prokaryotic cell, where pactamycin increases polyphenylalanine synthesis (Dinos et al., 2004). Pactamycin, even at high concentrations, did not have severe effects in the error frequency of the wild type strain or in that of the hyperaccurate rdn15 strain or in that of the error-prone sup45rdnwt strain. This result does not agree with the hyperaccuracy that pactamycin induces in prokaryotes but does not come in contrast to it either.
In the presence of both edeine and pactamycin the synthesis of polyphenylalanine was reduced, in contrast with what is observed in the prokaryotic ribosome (Dinos et al., 2004), even when pactamycin was used in higher concentrations than edeine. Thus, the simultaneous presence of both antibiotics does not seem to alter the character of the inhibition. These results are in favor of an additive effect of these antibiotics. Moreover, in the presence of high pactamycin concentrations, edeine induces a decrease in translational fidelity which is similar to that in the presence of edeine alone. The effects of these two antibiotics on the fidelity of translation are similar to those observed in the prokaryotic ribosome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/4121 |
| Date | 24 January 2011 |
| Creators | Ντούσκα, Μαρία |
| Contributors | Συνετός, Διονύσιος, Ntouska, Maria, Συνετός, Διονύσιος, Καλπαξής, Δημήτριος, Αναστασίου, Ευάγγελος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒKΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου. |
Page generated in 0.0051 seconds