Considerada a mais comum das doenças lisossômicas, a doença de Gaucher é causada por mutações no gene GBA1 que resultam na síntese defeituosa da enzima glicocerebrosidase (GBA), responsável pela hidrólise dos glicocerebrosídios em glicose e ceramida. A deficiência da enzima provoca o acúmulo desses glicolipídios nos macrófagos, principalmente no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um fenótipo complexo. O tratamento da doença consiste na administração da enzima GBA humana (HsGBA) exógena e, apesar de sua eficácia, é extremamente oneroso. Assim como outras espécies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii apresenta alto potencial para a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes de forma rápida e a um custo muito inferior ao dos sistemas de expressão tradicionais. O objetivo proposto para o desenvolvimento deste trabalho foi a expressão do gene codificador da HsGBA a partir do genoma nuclear de C. reinhardtii visando à produção da proteína como possível alternativa para a terapia de reposição enzimática. O gene HsGBA artificial foi projetado com códons adaptados para a expressão nuclear em C. reinhardtii e com sítios de restrição. A sequência nucleotídica foi sintetizada pela empresa GenScript USA Inc. e, após seu recebimento em plasmídeo de clonagem, o gene HsGBA foi inserido no plasmídeo pHsp70A/RbcS2-cgLuc por restrição com endonucleases e ligação. Esse vetor foi combinado com o plasmídeo pKS-aph7``-lox para a transferência do cassete de expressão do gene de interesse por recombinação sítio específica mediada pelo sistema Cre/lox, originando o vetor pKS-aph7``-lox::HsGBA, que contém, assim, os cassetes de expressão em tandem para HsGBA e para o marcador de seleção aph7``, codificador da enzima aminoglicosídeo fosfotransferase e capaz de conferir resistência à higromicina B. A linhagem de C. reinhardtii CC-400 cw15 mt+ foi transformada por eletroporação com o plasmídeo resultante linearizado (clivado com EcoRV) e na forma circular. A integração de HsGBA no genoma de cinco linhagens de C. reinhardtii foi comprovada por PCR e sua expressão foi demonstrada em três dessas linhagens de forma qualitativa por RT-PCR. Como HsGBA é controlado por um promotor induzível, hsp70A, diversas condições foram testadas visando à sua máxima expressão. Entretanto, análises por SDS-PAGE e western blot não permitiram a detecção da proteína recombinante. De modo semelhante, a atividade enzimática da HsGBA avaliada em extratos proteicos de linhagens transformadas não foi diferente da observada para linhagens não transformadas de C. reinhardtii. / Considered the most common lysosomal disorder, Gaucher disease is caused by mutations in GBA1 gene that result in defective synthesis of the enzyme glucocerebrosidase (GBA), responsible for the hydrolysis of glucocerebrosides into glucose and ceramide. When the enzyme is defective, these glycolipids accumulate in the macrophages, mainly in the liver, spleen and bone marrow, leading to a complex phenotype. Current treatment consists of enzyme replacement therapy by the administration of exogenous human GBA (HsGBA) and, in spite of its efficacy, it is exceptionally expensive. As other species of microalgae, Chlamydomonas reinhardtii has a high potential for production of large amounts of recombinant proteins rapidly and at a much lower cost than traditional expression systems. In the present work we proposed the expression of the HsGBA gene from the nuclear genome of C. reinhardtii aiming the production of the protein as a possible alternative to enzyme replacement therapy. The artificial HsGBA gene, adapted to the nuclear codon usage of C. reinhardtii, was designed with restriction sites and synthesized by GenScript USA Inc. The nucleotide sequence was provided in a cloning vector and the HsGBA gene was inserted into the plasmid pHsp70A/RbcS2-cgLuc by endonuclease digestion and ligation. The resulting vector was fused to the plasmid pKS-aph7``-lox for transferring of the expression cassette of the gene of interest by site-specific recombination mediated by the Cre/lox system, yielding the plasmid pKS-aph7``-lox::HsGBA. As a result, this tandem vector has the expression cassettes for HsGBA and for the selection marker aph7``, which encodes the aminoglycoside phosphotransferase enzyme that confers resistance to hygromycin B. The C. reinhardtii strain CC-400 cw15 mt+ was transformed by electroporation with the resulting plasmid, in the supercoiled and linear (digested with EcoRV) forms. The HsGBA integration into the genome of five strains of C. reinhardtii was confirmed by PCR and their expression was demonstrated qualitatively in three of these strains by RT-PCR. As the HsGBA gene is under the control of the inducible promoter hsp70A, several conditions were tested aiming its higher expression. However, the protein could not be detected by SDS-PAGE and western blot. Likewise, the enzymatic activity of the HsGBA was measured in protein extracts of the transgenic strains but did not differ from the control.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/170066 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Pizzoli, Guilherme |
| Contributors | Pasquali, Giancarlo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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