Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2012-10-20T10:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 209157.pdf: 1641394 bytes, checksum: cbd4f8512528c429750b081e53684823 (MD5) / Estudar as características clínicas, laboratoriais e radiológicas; demonstrar as principais mutações encontradas, relacionando-as com as formas clínicas e avaliar a resposta à terapia de reposição enzimática (TRE), nos pacientes com doença de Gaucher (DG) em Santa Catarina. Método: Foram estudados e acompanhados 10 pacientes com DG no Hospital Universitário de Florianópolis, no período compreendido entre 1998 e 2003, após a obtenção do consentimento informado e a confirmação diagnóstica da doença pela dosagem da enzima glucocerebrosidase em leucócitos de sangue periférico. A pesquisa das principais mutações foi realizada em amostras de sangue e de mucosa oral. Resultados: Houve um discreto predomínio do gênero masculino (60%). A média de idade ao diagnóstico foi de 19,6 anos. Quatro pacientes eram crianças e seis adultos. Um paciente era negro e nenhum era judeu. DG tipo 1 foi diagnosticada em 80% dos casos, tipo 2 em 20%. Quatro pacientes tiveram história familiar de DG. Hepatomegalia e esplenomegalia foram às manifestações clínicas mais comuns (ambas 80%). Anemia e trombocitopenia estiveram presentes em 100% dos casos. História de dores ósseas foram relatadas por 75% dos pacientes com DG tipo 1. Os alelos mutantes encontrados foram N370S e L444P, sendo a mutação N370S (60%) a mais freqüente. Independente do número de infusões da imiglucerase, houve um aumento dos níveis de hemoglobina, com uma média de acréscimo de 1,2g/dl, em todos os pacientes com DG tipo 1. Conclusões: DG tipo 1 é a forma clínica mais comum. Anemia, trombocitopenia, hepatoesplenomegalia e osteopenia, associadas à deficiência enzimática da beta-glicosidase são as características mais freqüentes dos pacientes com DG em Santa Catarina. O alelo N370S é o mais freqüente e está relacionado com o tipo 1. O alelo L444P em homozigose sugere letalidade precoce. O estudo do genótipo auxilia no suporte clínico e no aconselhamento genético. TRE é segura e efetiva para a DG tipo 1.

Considerada a mais comum das doenças lisossômicas, a doença de Gaucher é causada por mutações no gene GBA1 que resultam na síntese defeituosa da enzima glicocerebrosidase (GBA), responsável pela hidrólise dos glicocerebrosídios em glicose e ceramida. A deficiência da enzima provoca o acúmulo desses glicolipídios nos macrófagos, principalmente no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um fenótipo complexo. O tratamento da doença consiste na administração da enzima GBA humana (HsGBA) exógena e, apesar de sua eficácia, é extremamente oneroso. Assim como outras espécies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii apresenta alto potencial para a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes de forma rápida e a um custo muito inferior ao dos sistemas de expressão tradicionais. O objetivo proposto para o desenvolvimento deste trabalho foi a expressão do gene codificador da HsGBA a partir do genoma nuclear de C. reinhardtii visando à produção da proteína como possível alternativa para a terapia de reposição enzimática. O gene HsGBA artificial foi projetado com códons adaptados para a expressão nuclear em C. reinhardtii e com sítios de restrição. A sequência nucleotídica foi sintetizada pela empresa GenScript USA Inc. e, após seu recebimento em plasmídeo de clonagem, o gene HsGBA foi inserido no plasmídeo pHsp70A/RbcS2-cgLuc por restrição com endonucleases e ligação. Esse vetor foi combinado com o plasmídeo pKS-aph7``-lox para a transferência do cassete de expressão do gene de interesse por recombinação sítio específica mediada pelo sistema Cre/lox, originando o vetor pKS-aph7``-lox::HsGBA, que contém, assim, os cassetes de expressão em tandem para HsGBA e para o marcador de seleção aph7``, codificador da enzima aminoglicosídeo fosfotransferase e capaz de conferir resistência à higromicina B. A linhagem de C. reinhardtii CC-400 cw15 mt+ foi transformada por eletroporação com o plasmídeo resultante linearizado (clivado com EcoRV) e na forma circular. A integração de HsGBA no genoma de cinco linhagens de C. reinhardtii foi comprovada por PCR e sua expressão foi demonstrada em três dessas linhagens de forma qualitativa por RT-PCR. Como HsGBA é controlado por um promotor induzível, hsp70A, diversas condições foram testadas visando à sua máxima expressão. Entretanto, análises por SDS-PAGE e western blot não permitiram a detecção da proteína recombinante. De modo semelhante, a atividade enzimática da HsGBA avaliada em extratos proteicos de linhagens transformadas não foi diferente da observada para linhagens não transformadas de C. reinhardtii. / Considered the most common lysosomal disorder, Gaucher disease is caused by mutations in GBA1 gene that result in defective synthesis of the enzyme glucocerebrosidase (GBA), responsible for the hydrolysis of glucocerebrosides into glucose and ceramide. When the enzyme is defective, these glycolipids accumulate in the macrophages, mainly in the liver, spleen and bone marrow, leading to a complex phenotype. Current treatment consists of enzyme replacement therapy by the administration of exogenous human GBA (HsGBA) and, in spite of its efficacy, it is exceptionally expensive. As other species of microalgae, Chlamydomonas reinhardtii has a high potential for production of large amounts of recombinant proteins rapidly and at a much lower cost than traditional expression systems. In the present work we proposed the expression of the HsGBA gene from the nuclear genome of C. reinhardtii aiming the production of the protein as a possible alternative to enzyme replacement therapy. The artificial HsGBA gene, adapted to the nuclear codon usage of C. reinhardtii, was designed with restriction sites and synthesized by GenScript USA Inc. The nucleotide sequence was provided in a cloning vector and the HsGBA gene was inserted into the plasmid pHsp70A/RbcS2-cgLuc by endonuclease digestion and ligation. The resulting vector was fused to the plasmid pKS-aph7``-lox for transferring of the expression cassette of the gene of interest by site-specific recombination mediated by the Cre/lox system, yielding the plasmid pKS-aph7``-lox::HsGBA. As a result, this tandem vector has the expression cassettes for HsGBA and for the selection marker aph7``, which encodes the aminoglycoside phosphotransferase enzyme that confers resistance to hygromycin B. The C. reinhardtii strain CC-400 cw15 mt+ was transformed by electroporation with the resulting plasmid, in the supercoiled and linear (digested with EcoRV) forms. The HsGBA integration into the genome of five strains of C. reinhardtii was confirmed by PCR and their expression was demonstrated qualitatively in three of these strains by RT-PCR. As the HsGBA gene is under the control of the inducible promoter hsp70A, several conditions were tested aiming its higher expression. However, the protein could not be detected by SDS-PAGE and western blot. Likewise, the enzymatic activity of the HsGBA was measured in protein extracts of the transgenic strains but did not differ from the control.

Considerada a mais comum das doenças lisossômicas, a doença de Gaucher é causada por mutações no gene GBA1 que resultam na síntese defeituosa da enzima glicocerebrosidase (GBA), responsável pela hidrólise dos glicocerebrosídios em glicose e ceramida. A deficiência da enzima provoca o acúmulo desses glicolipídios nos macrófagos, principalmente no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um fenótipo complexo. O tratamento da doença consiste na administração da enzima GBA humana (HsGBA) exógena e, apesar de sua eficácia, é extremamente oneroso. Assim como outras espécies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii apresenta alto potencial para a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes de forma rápida e a um custo muito inferior ao dos sistemas de expressão tradicionais. O objetivo proposto para o desenvolvimento deste trabalho foi a expressão do gene codificador da HsGBA a partir do genoma nuclear de C. reinhardtii visando à produção da proteína como possível alternativa para a terapia de reposição enzimática. O gene HsGBA artificial foi projetado com códons adaptados para a expressão nuclear em C. reinhardtii e com sítios de restrição. A sequência nucleotídica foi sintetizada pela empresa GenScript USA Inc. e, após seu recebimento em plasmídeo de clonagem, o gene HsGBA foi inserido no plasmídeo pHsp70A/RbcS2-cgLuc por restrição com endonucleases e ligação. Esse vetor foi combinado com o plasmídeo pKS-aph7``-lox para a transferência do cassete de expressão do gene de interesse por recombinação sítio específica mediada pelo sistema Cre/lox, originando o vetor pKS-aph7``-lox::HsGBA, que contém, assim, os cassetes de expressão em tandem para HsGBA e para o marcador de seleção aph7``, codificador da enzima aminoglicosídeo fosfotransferase e capaz de conferir resistência à higromicina B. A linhagem de C. reinhardtii CC-400 cw15 mt+ foi transformada por eletroporação com o plasmídeo resultante linearizado (clivado com EcoRV) e na forma circular. A integração de HsGBA no genoma de cinco linhagens de C. reinhardtii foi comprovada por PCR e sua expressão foi demonstrada em três dessas linhagens de forma qualitativa por RT-PCR. Como HsGBA é controlado por um promotor induzível, hsp70A, diversas condições foram testadas visando à sua máxima expressão. Entretanto, análises por SDS-PAGE e western blot não permitiram a detecção da proteína recombinante. De modo semelhante, a atividade enzimática da HsGBA avaliada em extratos proteicos de linhagens transformadas não foi diferente da observada para linhagens não transformadas de C. reinhardtii. / Considered the most common lysosomal disorder, Gaucher disease is caused by mutations in GBA1 gene that result in defective synthesis of the enzyme glucocerebrosidase (GBA), responsible for the hydrolysis of glucocerebrosides into glucose and ceramide. When the enzyme is defective, these glycolipids accumulate in the macrophages, mainly in the liver, spleen and bone marrow, leading to a complex phenotype. Current treatment consists of enzyme replacement therapy by the administration of exogenous human GBA (HsGBA) and, in spite of its efficacy, it is exceptionally expensive. As other species of microalgae, Chlamydomonas reinhardtii has a high potential for production of large amounts of recombinant proteins rapidly and at a much lower cost than traditional expression systems. In the present work we proposed the expression of the HsGBA gene from the nuclear genome of C. reinhardtii aiming the production of the protein as a possible alternative to enzyme replacement therapy. The artificial HsGBA gene, adapted to the nuclear codon usage of C. reinhardtii, was designed with restriction sites and synthesized by GenScript USA Inc. The nucleotide sequence was provided in a cloning vector and the HsGBA gene was inserted into the plasmid pHsp70A/RbcS2-cgLuc by endonuclease digestion and ligation. The resulting vector was fused to the plasmid pKS-aph7``-lox for transferring of the expression cassette of the gene of interest by site-specific recombination mediated by the Cre/lox system, yielding the plasmid pKS-aph7``-lox::HsGBA. As a result, this tandem vector has the expression cassettes for HsGBA and for the selection marker aph7``, which encodes the aminoglycoside phosphotransferase enzyme that confers resistance to hygromycin B. The C. reinhardtii strain CC-400 cw15 mt+ was transformed by electroporation with the resulting plasmid, in the supercoiled and linear (digested with EcoRV) forms. The HsGBA integration into the genome of five strains of C. reinhardtii was confirmed by PCR and their expression was demonstrated qualitatively in three of these strains by RT-PCR. As the HsGBA gene is under the control of the inducible promoter hsp70A, several conditions were tested aiming its higher expression. However, the protein could not be detected by SDS-PAGE and western blot. Likewise, the enzymatic activity of the HsGBA was measured in protein extracts of the transgenic strains but did not differ from the control.

Considerada a mais comum das doenças lisossômicas, a doença de Gaucher é causada por mutações no gene GBA1 que resultam na síntese defeituosa da enzima glicocerebrosidase (GBA), responsável pela hidrólise dos glicocerebrosídios em glicose e ceramida. A deficiência da enzima provoca o acúmulo desses glicolipídios nos macrófagos, principalmente no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um fenótipo complexo. O tratamento da doença consiste na administração da enzima GBA humana (HsGBA) exógena e, apesar de sua eficácia, é extremamente oneroso. Assim como outras espécies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii apresenta alto potencial para a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes de forma rápida e a um custo muito inferior ao dos sistemas de expressão tradicionais. O objetivo proposto para o desenvolvimento deste trabalho foi a expressão do gene codificador da HsGBA a partir do genoma nuclear de C. reinhardtii visando à produção da proteína como possível alternativa para a terapia de reposição enzimática. O gene HsGBA artificial foi projetado com códons adaptados para a expressão nuclear em C. reinhardtii e com sítios de restrição. A sequência nucleotídica foi sintetizada pela empresa GenScript USA Inc. e, após seu recebimento em plasmídeo de clonagem, o gene HsGBA foi inserido no plasmídeo pHsp70A/RbcS2-cgLuc por restrição com endonucleases e ligação. Esse vetor foi combinado com o plasmídeo pKS-aph7``-lox para a transferência do cassete de expressão do gene de interesse por recombinação sítio específica mediada pelo sistema Cre/lox, originando o vetor pKS-aph7``-lox::HsGBA, que contém, assim, os cassetes de expressão em tandem para HsGBA e para o marcador de seleção aph7``, codificador da enzima aminoglicosídeo fosfotransferase e capaz de conferir resistência à higromicina B. A linhagem de C. reinhardtii CC-400 cw15 mt+ foi transformada por eletroporação com o plasmídeo resultante linearizado (clivado com EcoRV) e na forma circular. A integração de HsGBA no genoma de cinco linhagens de C. reinhardtii foi comprovada por PCR e sua expressão foi demonstrada em três dessas linhagens de forma qualitativa por RT-PCR. Como HsGBA é controlado por um promotor induzível, hsp70A, diversas condições foram testadas visando à sua máxima expressão. Entretanto, análises por SDS-PAGE e western blot não permitiram a detecção da proteína recombinante. De modo semelhante, a atividade enzimática da HsGBA avaliada em extratos proteicos de linhagens transformadas não foi diferente da observada para linhagens não transformadas de C. reinhardtii. / Considered the most common lysosomal disorder, Gaucher disease is caused by mutations in GBA1 gene that result in defective synthesis of the enzyme glucocerebrosidase (GBA), responsible for the hydrolysis of glucocerebrosides into glucose and ceramide. When the enzyme is defective, these glycolipids accumulate in the macrophages, mainly in the liver, spleen and bone marrow, leading to a complex phenotype. Current treatment consists of enzyme replacement therapy by the administration of exogenous human GBA (HsGBA) and, in spite of its efficacy, it is exceptionally expensive. As other species of microalgae, Chlamydomonas reinhardtii has a high potential for production of large amounts of recombinant proteins rapidly and at a much lower cost than traditional expression systems. In the present work we proposed the expression of the HsGBA gene from the nuclear genome of C. reinhardtii aiming the production of the protein as a possible alternative to enzyme replacement therapy. The artificial HsGBA gene, adapted to the nuclear codon usage of C. reinhardtii, was designed with restriction sites and synthesized by GenScript USA Inc. The nucleotide sequence was provided in a cloning vector and the HsGBA gene was inserted into the plasmid pHsp70A/RbcS2-cgLuc by endonuclease digestion and ligation. The resulting vector was fused to the plasmid pKS-aph7``-lox for transferring of the expression cassette of the gene of interest by site-specific recombination mediated by the Cre/lox system, yielding the plasmid pKS-aph7``-lox::HsGBA. As a result, this tandem vector has the expression cassettes for HsGBA and for the selection marker aph7``, which encodes the aminoglycoside phosphotransferase enzyme that confers resistance to hygromycin B. The C. reinhardtii strain CC-400 cw15 mt+ was transformed by electroporation with the resulting plasmid, in the supercoiled and linear (digested with EcoRV) forms. The HsGBA integration into the genome of five strains of C. reinhardtii was confirmed by PCR and their expression was demonstrated qualitatively in three of these strains by RT-PCR. As the HsGBA gene is under the control of the inducible promoter hsp70A, several conditions were tested aiming its higher expression. However, the protein could not be detected by SDS-PAGE and western blot. Likewise, the enzymatic activity of the HsGBA was measured in protein extracts of the transgenic strains but did not differ from the control.

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A Doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose causada por mutações no gene da -glicosidase, ocasionando depósito lisossomal de glicosilceramida (GliCer), principalmente, nas células do sistema mononuclear fagocitário. O diagnóstico da DG é, normalmente, confirmado pela determinação enzimática e/ou pela caracterização molecular. Neste trabalho nos propusemos a: (1) confirmar o diagnóstico de uma amostra de indivíduos com DG através da medida da atividade da -glicosidase e da quitotriosidase (QT); (2) extrair, purificar e quantificar a GliCer de plasma de pacientes com DG com e sem tratamento por reposição enzimática (TRE) e de indivíduos normais, comparando o conteúdo deste lipídio entre os grupos mencionados e (3) comparar a concentração plasmática da quemoquina CCL18/PARC entre os 3 grupos acima. Os leucócitos e o plasma de cada indivíduo foram separados por centrifugação. A atividade da -glicosidase em leucócitos dos pacientes com DG foi 5% daquela de indivíduos normais e a quitotriosidase estava 500 vezes aumentada nos pacientes com DG. O plasma de cada indivíduo foi tratado, seqüencialmente, com três sistemas de solventes: clorofórmio (C): metanol (M) em três proporções distintas. Os três extratos lipídicos totais de cada amostra foram reunidos (extrato lipídico total) e evaporados a seco (resíduo). Este resíduo de extrato lipídico total foi submetido, seqüencialmente, a uma coluna de ácido silícico, à metanólise alcalina e a uma coluna Sep-Pack. Desta coluna resultaram os eluatos C:M:água (3:48:47) e (60:30:4,5). Após ajustes necessários obtivemos a purificação de glicosilceramida numa única fração. A análise destes eluatos por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC) e com revelação química (CuSO4/H3PO4) mostrou que ambos continham uma banda com velocidade de migração semelhante a do padrão de GliCer. A confirmação da identidade desta banda foi realizada por imunorevelação usando anticorpo primário anti-GliCer e secundário conjugado a peroxidase. Pacientes com DG sem tratamento por TRE apresentaram, aproximadamente, 20 vezes mais GliCer que indivíduos normais e 11 vezes mais que pacientes com tratamento. Com a dosagem plasmática da quemoquina CCL18/PARC, observamos que pacientes com DG possuíam uma concentração da mesma 28 vezes aumentada em relação aos indivíduos normais e 17 vezes mais elevada que a de pacientes com tratamento. Ou seja, podemos detectar uma redução de 90% da concentração de GliCer e de 40% na concentração de CCL18/PARC nos pacientes com DG com TRE em comparação com as respectivas concentrações nos paciente com DG sem tratamento. A metodologia estabelecida neste trabalho permitiu extrair, purificar, separar, detectar e quantificar GliCer no plasma de pacientes com DG com e sem tratamento por TRE, bem como, GliCer de indivíduos normais. Tanto a quantificação da GliCer quanto a dosagem de CCL18/PARC permitiram identificar, através dos respectivos valores obtidos de plasma, os grupos de indivíduos analisados. Portanto, estas duas avaliações podem ser associadas à determinação da atividade da quitotriosidase como biomarcadores da DG. / Gaucher’s disease (GD) is a sphingolipidosis caused by mutations in the β-glucosidase gene, causing lysosomal storage of glucosylceramide (GluCer) mainly in the mononuclear phagocyte system cells. As a rule, GD diagnosis is confirmed by enzyme determination and/or molecular characterization. The objectives of the present study were (1) to confirm GD diagnosis in a sample of subjects by measuring β-glucosidase activity and chitotriosidase activity, (2) to extract, purify and quantify GluCer in the plasma of patients with GD with and without enzyme replacement therapy (ERT) and of healthy individuals, comparing the content of the lipid between the groups, and (3) the compare the plasma concentration of chemokine CCL18/PARC between the three groups. Plasma of each individual was centrifuged to obtain leukocytes. β-glucosidase activity in leukocytes of patients with GD represented a 5% share of that of healthy individuals, while chitotriosidase activity was 500 times higher in GD patients. Plasma was treated sequentially with a chloroform:methanol solvent system as three sequential solution ratios. The three total lipid extracts of each sample were pooled (total lipid extract) and evaporated to dryness to obtain a residue. This residue was sequentially treated in a salicylic acid column and a Sep-Pak™ column for alkaline methanolysis, from which two chloroform:methanol:water eluates were obtained (3:48:47 and 60:30:4.5). After the required adjustments, GluCer was purified as a single fraction. High performance thin-layer chromatography (HPTLC) and chemical development using CuSO4 and H3PO4 showed that both eluates had a band whose migration speed was similar to the GluCer standard. Confirmation of this band’s identity was conducted by immune development using anti-GluCer primary antibody and peroxidase-conjugated secondary antibody. GluCer levels in DG patients without ERT treatment were approximately 20 times higher than in healthy individuals and 11 times higher than in patients under treatment. Plasma chemokine CCL18/PARC levels in DG patients without treatment were 28 and 17 times higher as compared to healthy and individuals DG patients under treatment, respectively. This accounts for a 90% decrease in GluCer levels and a 40% decrease in CCL18/PARC levels in GD patients with ERT in comparison to DG patients without treatment. The methodology described in this paper afforded to quantify GluCer in plasma of DG individuals with and without ERT as well as GluCer levels in healthy individuals. Quantification of GluCer and CCL18/PARC levels in plasma afforded to identify the groups of individuals analyzed. Therefore, these two parameters may be associated to the determination of chitotriosidase activity as GD biomarkers.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glicocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo em macrófagos. Embora o macrófago venha sendo a célula mais estudada, alguns achados sugerem que outras células do sistema imune possam ter papel importante na fisiopatologia da DG. Os pacientes com DG apresentam níveis elevados de imunoglobulinas e uma maior incidência de malignidades hematológicas, possivelmente devido ao desbalanço da regulação de citocinas inflamatórias. Objetivo: Caracterizar o envolvimento do sistema imune na DG ao analisar alterações clínicas e bioquímicas, variabilidade dos genes HLA e KIR e a expressão de citocinas em uma coorte de pacientes com DG do Estado do Rio Grande do Sul. Metodologia: Para o estudo relacionado aos genes HLA e KIR, 31 pacientes com DG tipo I foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis. Para os estudos relacionados à variação de citocinas, foram obtidas amostras de 14 pacientes com DG tipo I fora de tratamento e após 6 meses de tratamento regular. Resultados/Discussão: O alelo HLA B37 foi mais frequente em pacientes com DG do que nos controles (p=0,01). A idade de início dos sintomas foi associada à combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O BDNF está diminuído em pacientes com DG em relação a controles saudáveis e aumenta significativamente após a TRE, enquanto a osteopontina parece ser mais sensível que a quitotriosidase para avaliação de resposta ao tratamento. Ao avaliar a variação das citocinas, encontramos uma diminuição significativa de TNF-α, MIP-1α, MIP-1β e MDC e um aumento significativo de GRO, PAI-1 e leptina após tratamento. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a expressão fenotípica de pacientes com DG. Além disso, demonstramos a variabilidade de diferentes 12 citocinas após o tratamento, podendo algumas delas ser utilizadas para monitorização de resposta ao tratamento dos pacientes. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the macrophages and a chronic stimulation of the immune system. Although the macrophage has been better studied, there are some findings regarding the role of other immunological cells in the pathophysiology of GD. GD patients have elevated levels of immunoglobulins and an increased incidence of hematological malignancies, possibly due to the imbalance of regulatory cytokines. Objectives: To characterize the involvement of the immune system in GD by analyzing clinical and biochemical features, variability of HLA and KIR genes and the cytokines expression in a cohort of patients from Rio Grande do Sul, Brazil. Methodology: Regarding the HLA and KIR genes study, DNA samples from 31 patients with GD type I were analyzed and compared to 250 healthy controls. For studies related to the variation of cytokines, samples from 14 patients with Gaucher type I off treatment and after 6 months of regular treatment were compared. Results/Discussion: The HLA B37 allele was more frequent in patients with GD than in controls (p = 0.01). The age of onset was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with its ligand HLA-C1 (p = 0.038). Patients with the HLA-C2 appear to exhibit increased susceptibility to develop monoclonal or polyclonal bands on protein electrophoresis (p = 0.007, OR = 21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. BDNF is decreased in patients with GD compared to healthy controls and increases after ERT while osteopontin seems to be more sensitive than chitotriosidase for assessing response to treatment. When evaluating the variation of cytokines, we found a significant decrease of TNF-α, MIP-1α, MIP-1β and MDC and significant increased GRO, PAI-1 and leptin after treatment. Conclusion: Our data suggest a possible association between variants of KIR and HLA genes and phenotypic expression presented by GD patients. Furthermore, we demonstrate the variability of different cytokines after treatment and some of them can be used for monitoring the response to treatment of patients.

Orientador : Prof. Dr. Dante Luiz Escuissato / Coorientadora : Profª. Drª. Ida Vanessa Doederlein Schwartz / Coorientador : Prof. Dr. Arnolfo de Carvalho Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 24/06/2016 / Inclui referências : f. 26-28 / Resumo: A doença de Gaucher (DG) é uma das doenças lisossômicas mais frequentes. Ela é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glicocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células. A DG tipo 1 é classicamente conhecida como a forma não neuronopática da doença, com alterações ósseas e viscerais sendo o principal achado. Entretanto, manifestações clínicas neurológicas já foram descritas nesses pacientes. A espectroscopia de prótons por ressonância magnética (ERM) é uma ferramenta diagnóstica não invasiva para detectar e quantificar diferentes metabólitos. Já foi demonstrado que formas neuronopáticas de DG (tipos 2 e 3 ) apresentam pico de lipídio e uma maior relação colina / creatina em estudos por ERM. Na forma não neuronopática da DG, também foi encontrado aumento da relação colina/ creatina na ERM. A ressonância magnética (RM) pode ser usada como método semiquantitativo para avaliar a gravidade de doença óssea em pacientes com DG. O escore mais usado atualmente é o escore bone marrow burden (BMB), que varia de 0 (normal) até 16 (envolvimento mais grave). O objetivo do estudo é correlacionar os metabólitos cerebrais por ERM com a gravidade de doença óssea usando o escore BMB. Onze paciente com DG tipo 1 (média de idade: 30,3 anos; desvio padrão: 10,8) foram submetidos à RM do encéfalo, coluna lombar e fêmur. ERM foi realizada nos núcleos da base e as relações colina/creatina e n-acetil-aspartato/creatina foram calculados. O estudo por RM da coluna lombar e dos fêmures foi realizado no mesmo dia e o escore BMB foi calculado. A razão dos metabólitos encontrados foi correlacionado com o escore ósseo de cada paciente. A média do escore BMB foi de 7,7. Observou-se uma correlação baixa positiva entre o escore BMB e a razão colina/ creatina (r=0,16) e um correlação moderada negativa entre o escore BMB e a razão n-acetil-aspartato/creatina (r=0,40). Conclui-se que um escore BMB maior em pacientes com DG tipo 1 pode estar relacionado a uma maior relação colina/ creatina e menor relação n-acetil-aspartato/creatina em estudos por ERM cerebral. Palavras chave: doença de Gaucher tipo 1, escore BMB, espectroscopia de prótons. / Abstract: Gaucher's Disease (GD) is one of the most frequent lisosomal disorders. It is caused by reduced activity of the lisosomal enzyme glicocerebrosidase, which leads to intracellular accumulation of glicocerebrosideos. Type 1 GD is classically known as the non-neuronopathic form, with bone and visceral abnormalities being its main clinical findings. However, clinical neurological manifestations have been described on theses patients. Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-MRS) is a diagnostic non-invasive imaging tool to detect and quantify different metabolites. It has been demonstrated that neuronopathic forms of GD (types 2 and 3) shows a lipid peak and a higher choline/creatine ratios in brain 1H-MRS studies. For the non-neuronopathic form of GD, 1H-MRS has also depicted higher choline/creatine ratios ratios. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is a semiquantitative method to evaluate severity of bone marrow infiltration in patients with GD. The most used score is the bone marrow burden score (BMB) which goes from 0 (normal) to 16 (most severe involvement). The aim of our study is to correlate 1H-MRS brain metabolites to severity of bone marrow involvement using BMB score. Eleven patients with type 1 GD (mean age of 30,3 years) were submitted to brain, lumbar spine, and femur MRI. 1HMRS was performed on basal ganglia and choline/creatine and N-acetylaspartate/ creatine ratios were calculated. Lumbar spine and femur MRI were performed at the same day and the BMB score was calculated.1H-MRS metabolite ratios were compared to the BMB score. BMB average score was 8. There was a low positive correlation between BMB score and choline/creatine (r=0,16) and a moderate negative correlation between BMB score and N-acetyl-aspartate/ creatine (r=-0,40). In conclusion, a higher BMB score in type 1 GD may correlates to a higher choline/creatine and lower Nacetyl- aspartate/ creatine in brain 1H-MRS. Key-words: type 1 Gaucher's disease, BMB score, proton spectroscopy.

A Doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose causada por mutações no gene da -glicosidase, ocasionando depósito lisossomal de glicosilceramida (GliCer), principalmente, nas células do sistema mononuclear fagocitário. O diagnóstico da DG é, normalmente, confirmado pela determinação enzimática e/ou pela caracterização molecular. Neste trabalho nos propusemos a: (1) confirmar o diagnóstico de uma amostra de indivíduos com DG através da medida da atividade da -glicosidase e da quitotriosidase (QT); (2) extrair, purificar e quantificar a GliCer de plasma de pacientes com DG com e sem tratamento por reposição enzimática (TRE) e de indivíduos normais, comparando o conteúdo deste lipídio entre os grupos mencionados e (3) comparar a concentração plasmática da quemoquina CCL18/PARC entre os 3 grupos acima. Os leucócitos e o plasma de cada indivíduo foram separados por centrifugação. A atividade da -glicosidase em leucócitos dos pacientes com DG foi 5% daquela de indivíduos normais e a quitotriosidase estava 500 vezes aumentada nos pacientes com DG. O plasma de cada indivíduo foi tratado, seqüencialmente, com três sistemas de solventes: clorofórmio (C): metanol (M) em três proporções distintas. Os três extratos lipídicos totais de cada amostra foram reunidos (extrato lipídico total) e evaporados a seco (resíduo). Este resíduo de extrato lipídico total foi submetido, seqüencialmente, a uma coluna de ácido silícico, à metanólise alcalina e a uma coluna Sep-Pack. Desta coluna resultaram os eluatos C:M:água (3:48:47) e (60:30:4,5). Após ajustes necessários obtivemos a purificação de glicosilceramida numa única fração. A análise destes eluatos por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC) e com revelação química (CuSO4/H3PO4) mostrou que ambos continham uma banda com velocidade de migração semelhante a do padrão de GliCer. A confirmação da identidade desta banda foi realizada por imunorevelação usando anticorpo primário anti-GliCer e secundário conjugado a peroxidase. Pacientes com DG sem tratamento por TRE apresentaram, aproximadamente, 20 vezes mais GliCer que indivíduos normais e 11 vezes mais que pacientes com tratamento. Com a dosagem plasmática da quemoquina CCL18/PARC, observamos que pacientes com DG possuíam uma concentração da mesma 28 vezes aumentada em relação aos indivíduos normais e 17 vezes mais elevada que a de pacientes com tratamento. Ou seja, podemos detectar uma redução de 90% da concentração de GliCer e de 40% na concentração de CCL18/PARC nos pacientes com DG com TRE em comparação com as respectivas concentrações nos paciente com DG sem tratamento. A metodologia estabelecida neste trabalho permitiu extrair, purificar, separar, detectar e quantificar GliCer no plasma de pacientes com DG com e sem tratamento por TRE, bem como, GliCer de indivíduos normais. Tanto a quantificação da GliCer quanto a dosagem de CCL18/PARC permitiram identificar, através dos respectivos valores obtidos de plasma, os grupos de indivíduos analisados. Portanto, estas duas avaliações podem ser associadas à determinação da atividade da quitotriosidase como biomarcadores da DG. / Gaucher’s disease (GD) is a sphingolipidosis caused by mutations in the β-glucosidase gene, causing lysosomal storage of glucosylceramide (GluCer) mainly in the mononuclear phagocyte system cells. As a rule, GD diagnosis is confirmed by enzyme determination and/or molecular characterization. The objectives of the present study were (1) to confirm GD diagnosis in a sample of subjects by measuring β-glucosidase activity and chitotriosidase activity, (2) to extract, purify and quantify GluCer in the plasma of patients with GD with and without enzyme replacement therapy (ERT) and of healthy individuals, comparing the content of the lipid between the groups, and (3) the compare the plasma concentration of chemokine CCL18/PARC between the three groups. Plasma of each individual was centrifuged to obtain leukocytes. β-glucosidase activity in leukocytes of patients with GD represented a 5% share of that of healthy individuals, while chitotriosidase activity was 500 times higher in GD patients. Plasma was treated sequentially with a chloroform:methanol solvent system as three sequential solution ratios. The three total lipid extracts of each sample were pooled (total lipid extract) and evaporated to dryness to obtain a residue. This residue was sequentially treated in a salicylic acid column and a Sep-Pak™ column for alkaline methanolysis, from which two chloroform:methanol:water eluates were obtained (3:48:47 and 60:30:4.5). After the required adjustments, GluCer was purified as a single fraction. High performance thin-layer chromatography (HPTLC) and chemical development using CuSO4 and H3PO4 showed that both eluates had a band whose migration speed was similar to the GluCer standard. Confirmation of this band’s identity was conducted by immune development using anti-GluCer primary antibody and peroxidase-conjugated secondary antibody. GluCer levels in DG patients without ERT treatment were approximately 20 times higher than in healthy individuals and 11 times higher than in patients under treatment. Plasma chemokine CCL18/PARC levels in DG patients without treatment were 28 and 17 times higher as compared to healthy and individuals DG patients under treatment, respectively. This accounts for a 90% decrease in GluCer levels and a 40% decrease in CCL18/PARC levels in GD patients with ERT in comparison to DG patients without treatment. The methodology described in this paper afforded to quantify GluCer in plasma of DG individuals with and without ERT as well as GluCer levels in healthy individuals. Quantification of GluCer and CCL18/PARC levels in plasma afforded to identify the groups of individuals analyzed. Therefore, these two parameters may be associated to the determination of chitotriosidase activity as GD biomarkers.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glicocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo em macrófagos. Embora o macrófago venha sendo a célula mais estudada, alguns achados sugerem que outras células do sistema imune possam ter papel importante na fisiopatologia da DG. Os pacientes com DG apresentam níveis elevados de imunoglobulinas e uma maior incidência de malignidades hematológicas, possivelmente devido ao desbalanço da regulação de citocinas inflamatórias. Objetivo: Caracterizar o envolvimento do sistema imune na DG ao analisar alterações clínicas e bioquímicas, variabilidade dos genes HLA e KIR e a expressão de citocinas em uma coorte de pacientes com DG do Estado do Rio Grande do Sul. Metodologia: Para o estudo relacionado aos genes HLA e KIR, 31 pacientes com DG tipo I foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis. Para os estudos relacionados à variação de citocinas, foram obtidas amostras de 14 pacientes com DG tipo I fora de tratamento e após 6 meses de tratamento regular. Resultados/Discussão: O alelo HLA B37 foi mais frequente em pacientes com DG do que nos controles (p=0,01). A idade de início dos sintomas foi associada à combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O BDNF está diminuído em pacientes com DG em relação a controles saudáveis e aumenta significativamente após a TRE, enquanto a osteopontina parece ser mais sensível que a quitotriosidase para avaliação de resposta ao tratamento. Ao avaliar a variação das citocinas, encontramos uma diminuição significativa de TNF-α, MIP-1α, MIP-1β e MDC e um aumento significativo de GRO, PAI-1 e leptina após tratamento. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a expressão fenotípica de pacientes com DG. Além disso, demonstramos a variabilidade de diferentes 12 citocinas após o tratamento, podendo algumas delas ser utilizadas para monitorização de resposta ao tratamento dos pacientes. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the macrophages and a chronic stimulation of the immune system. Although the macrophage has been better studied, there are some findings regarding the role of other immunological cells in the pathophysiology of GD. GD patients have elevated levels of immunoglobulins and an increased incidence of hematological malignancies, possibly due to the imbalance of regulatory cytokines. Objectives: To characterize the involvement of the immune system in GD by analyzing clinical and biochemical features, variability of HLA and KIR genes and the cytokines expression in a cohort of patients from Rio Grande do Sul, Brazil. Methodology: Regarding the HLA and KIR genes study, DNA samples from 31 patients with GD type I were analyzed and compared to 250 healthy controls. For studies related to the variation of cytokines, samples from 14 patients with Gaucher type I off treatment and after 6 months of regular treatment were compared. Results/Discussion: The HLA B37 allele was more frequent in patients with GD than in controls (p = 0.01). The age of onset was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with its ligand HLA-C1 (p = 0.038). Patients with the HLA-C2 appear to exhibit increased susceptibility to develop monoclonal or polyclonal bands on protein electrophoresis (p = 0.007, OR = 21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. BDNF is decreased in patients with GD compared to healthy controls and increases after ERT while osteopontin seems to be more sensitive than chitotriosidase for assessing response to treatment. When evaluating the variation of cytokines, we found a significant decrease of TNF-α, MIP-1α, MIP-1β and MDC and significant increased GRO, PAI-1 and leptin after treatment. Conclusion: Our data suggest a possible association between variants of KIR and HLA genes and phenotypic expression presented by GD patients. Furthermore, we demonstrate the variability of different cytokines after treatment and some of them can be used for monitoring the response to treatment of patients.