L’agent pathogène Phytophthora parasitica est un oomycète qui a des effets dévastateurs sur l’agriculture et les écosystèmes naturels. En tant qu'organisme hémi-biotrophe, il infecte les racines des plantes en établissant d'abord un contact intime avec les cellules hôtes (biotrophie) avant de les tuer (nécrotrophie) et de terminer son cycle d'infection. Pour contrôler ces processus, les oomycètes sécrètent des protéines effectrices, qui sont internalisées dans les cellules végétales par un motif de translocation (appelé RxLR-EER) pour manipuler la physiologie et les réponses immunitaires de l'hôte. Les études des échanges moléculaires entre Phytophthora parasitica et la plante qui ont été menées par le laboratoire d'accueil ont permis d'identifier un effecteur RxLR, dénommé Avh195. La séquence en acides aminés de l'effecteur est caractérisée par la présence de cinq motifs AIM (« ATG8 Interacting Motive ») qui indiquent une interaction potentielle avec la protéine centrale de l’autophagie, ATG8. Avh195 co-localise avec la fraction membranaire de l'ATG8, et un système double-hybride en levure permettant la détermination d’interactions entre protéines membranaires, a confirmé une interaction non sélective entre Avh195 et plusieurs isoformes d'ATG8. La caractérisation de la perturbation de l'autophagie dépendante de Avh195 a été réalisée dans l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii après génération de lignées transgéniques surexprimant l'effecteur. Les analyses par cytométrie de flux ont révélé que Avh195 ne modifie pas la physiologie et la « fitness » de l'algue dans des conditions de croissance normales et pendant l'autophagie induite par la rapamycine. La microscopie électronique à transmission a révélé que l'effecteur provoque dans les cellules de l’algue un retard dans le flux autophagique, se traduisant par une réduction de la coalescence et de la clairance des vacuoles et une forte accumulation d'amidon dans les chloroplastes. Cependant, ce phénotype est transitoire et seulement légèrement lié aux modifications de la régulation transcriptionnelle de la machinerie autophagique. L'analyse de la fonction effectrice chez les plantes a montré que Avh195 retarde le développement de la mort cellulaire hypersensible, déclenchée par un éliciteur d’oomycète. Cette activité dépend de trois AIM sur cinq, ce qui renforce encore l’importance de l’interaction Avh195-ATG8 pour la fonction de l’effecteur. La surexpression stable d'Avh195 chez A. thaliana a permis de déterminer que l'effecteur n'altère pas les réponses immunitaires des plantes, mais favorise globalement le développement de l'agent pathogène, accélérant le passage de la biotrophie à la nécrotrophie au cours de l'infection. À notre connaissance, le travail présenté dans cette thèse représente la première preuve qu'un effecteur d’oomycète possède une activité transitoire, ciblant de manière non sélective la protéine ATG8 dans différents organismes photosynthétiques pour ralentir le flux autophagique, favorisant ainsi le mode de vie hémi-biotrophe d'un agent pathogène. / The plant pathogen Phytophthora parasitica is an oomycete with devastating impact on both agriculture and natural ecosystems. As a hemi-biotrophic organism it infects the roots of plants first establishing an intimate contact with host cells (biotrophy) before killing them (necrotrophy) and completing its infection cycle. To control these processes, oomycetes secrete effector proteins, which are internalized in plant cells by a translocation motif (called RxLR-EER) to manipulate the physiology and the immune responses of the host. Studies of the molecular exchanges between Phytophthora parasitica and the plant that were conducted by the hosting laboratory led to the identification of an RxLR effector, designed to as Avh195. The amino acid sequence of the effector is characterized by the presence of five AIMs (ATG8 interacting motifs), that indicate a potential interaction with the autophagic core protein, ATG8. Avh195 colocalizes with the membrane-bound fraction of ATG8, and a yeast two-hybrid system, which allows to determine interactions between membrane proteins, confirmed a non-selective interaction between Avh195 and several ATG8 isoforms. The characterization of Avh195-dependent autophagy perturbation was carried out in the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii after generation of transgenic lines overexpressing the effector. Analyses by flow cytometry revealed that Avh195 does not modify the physiology and fitness of the alga, both under normal growth conditions and during rapamycin-induced autophagy. Transmission electron microscopy of cells revealed that the effector provokes a delay in the autophagic flux, manifested as a reduced coalescence and clearance of autophagic vacuoles and a strong accumulation of starch in chloroplasts. However, this phenotype was transient and only slightly related to modifications in the transcriptional regulation of the autophagic machinery. The analysis of effector function in planta showed that Avh195 delays the development of hypersensitive cell death, which is triggered by an oomycete elicitor. This cell death-delaying activity is dependent on three out of five AIMs, further consolidating the importance of the Avh195-ATG8 interaction for the function of the effector. The stable overexpression of Avh195 in A. thaliana allowed to determine that the effector does not impair plant defense responses, but overall promotes the development of the pathogen, accelerating the switch from biotrophy to necrotrophy during infection. To our knowledge, the work presented in this thesis represents the first evidence for an oomycete effector to possess a transitory activity, which targets in a non-selective manner the protein ATG8 in different organisms from the green lineage to slow down autophagic flux, thus promoting the hemibiotrophic life style of a pathogen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018AZUR4087 |
| Date | 26 October 2018 |
| Creators | Testi, Serena |
| Contributors | Côte d'Azur, Panabières, Franck, Keller, Harald |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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