Les catalases, les peroxydases et les catalase-peroxydases sont des hémoprotéines, dont l'activité enzymatique essentielle est la régulation de la concentration cellulaire du peroxyde d'hydrogène. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis en évidence et caractérisé, dans ces protéines, des intermédiaires réactionnels issus de l'oxydation de tyrosines et/ou de tryptophanes, alternatifs au composé I, [Fe(IV)=O Por•+]. La prise en compte de la formation de tels radicaux protéiques nous a amené à réexaminer le mécanisme des catalases et des peroxydases, jusque là centré sur l'oxydo-réduction de l'hème. Pour déterminer les structures électroniques et la réactivité des intermédiaires réactionnels, nous avons utilisé une approche multidisciplinaire combinant les spectroscopies de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) multifréquences (9-285 GHz), d'absorption électronique UV-visible par stopped-flow, ainsi que la mutagenèse dirigée et le marquage isotopique. L'étude comparative de huit catalases, provenant de souches bactériennes et de mammifères, nous a permis de démontrer que la température de réaction, le pH et l'excès d'oxydant favorisent la formation de l'intermédiaire [Fe(IV)=O Tyr•], résultant du transfert d'électron intramoléculaire entre la tyrosine et la porphyrine dans les catalases de foie de boeuf, d'érythrocytes humains, de B. abortus et de M. lysodeikticus. Nos études ont montré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] est prédominant à T ≥ 20°C. Ceci explique pourquoi les études cinétiques de la littérature, pour lesquelles seule l'absorption UV-visible à température ambiante a été utilisée, n'avaient pas permis de mettre en évidence la formation du radical tyrosyle. Nos résultats expliqueraient aussi les différences d'efficacité de dismutation du peroxyde d'hydrogène de ces catalases. En effet, le transfert spontané d'électron entre la tyrosine et la porphyrine, favorisé dans certaines catalases, serait en compétition avec la réaction entre l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] et le peroxyde d'hydrogène. Dans le cadre d'études spécifiques sur les catalase-peroxydases (KatGs) et en utilisant la catalase-peroxydase de B. pseudomallei comme cas d'étude, nous avons pu mettre en évidence la formation d'un radical tyrosyle et de deux intermédiaires tryptophanyles, dont l'un est formé sur le Trp330, équivalent au site radicalaire de la cytochrome c peroxydase. Nous avons démontré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] réagit avec l'ABTS et que le [Fe(IV)=O Trp330 •+] n'est pas l'intermédiaire réactif vis-à-vis de l'isoniazide (antibiotique utilisé dans le traitement de la tuberculose). Notre étude comparative de sept catalaseperoxydases a démontré que le site de formation du radical tryptophanyle est unique pour chaque enzyme, mais peut différer entre deux protéines, ce qui expliquerait en partie leurs différences de réactivité vis-à-vis de l'ABTS et de l'isoniazide. Nous avons montré que dans les catalase-peroxydases, les radicaux protéiques peuvent jouer le rôle de cofacteurs dans l'oxydation des substrats et que le mécanisme de la réaction de dismutation du peroxyde d'hydrogène diffère de celui des catalases monofonctionnelles. Afin de comprendre les propriétés physico-chimiques permettant et favorisant la formation des radicaux protéiques, en tant qu'intermédiaires alternatifs à l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+], nous avons caractérisé une peroxydase de raifort reconstituée, dans laquelle l'hème à été remplacé par un hème lié par liaison covalente à une tyrosine ou à un tryptophane.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00326339 |
| Date | 21 February 2008 |
| Creators | Colin, Julie |
| Publisher | Université Pierre et Marie Curie - Paris VI |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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