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Previous issue date: 2018-08-28 / Pectinases are enzymes in increasing use in the industrial sector as in the juice, wine, food, paper and fabric industries. They can be produced by a variety of microorganisms, but the fungi have greater advantages because they adapt to the great variety of substrates, they have a fast growth and they present wide prevalence in the environment. Pectinases act on pectin, which is one of the major components of the cell wall of plants and is rich in galacturonic acid (GalA). Among pectinases, polygalacturonase (PG) degrades the pectin molecule by acting internally and randomly in the chain, releasing oligosaccharides (endo-PG), or by attacking the non-reducing end of the chain, releasing monosaccharides (exo-PG). In view of the above, the objective of this work was to investigate the production of a polygalacturonase from the fungus Penicillium janthinellum VI2R3M, which was isolated from the Atlantic Forest of the West of Paraná, and afterwards, to purify, characterize and test a possible applicability. The enzyme was produced by culturing in Khanna medium, then purified through chromatographic columns and its purity and molecular weight confirmed by electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE). Subsequently, the enzyme was biochemically characterized in terms of pH, temperature, influence of metal ions, substrate specificity, hydrolysis products, molecular weight, kinetic parameters (Km, Vmáx, Kcat) and application of juice clarification. A PG was purified after two chromatographic steps involving ion exchange columns (DEAE-Sephadex) and molecular filtration (Sephadex G100). The purity and molecular mass (102.0 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE. The enzyme showed maximum activity at pH 5.0 and temperature at 50 °C, remaining 100% stable at 50 °C for 30 minutes and 80% at pH 3.0 to 5.0 for 24 hours. The Mg2+ metal ion increased enzyme activity significantly. Kinetic parameters, that is, Km, Vmax e Kcat for pectin hydrolysis were 2.56 mg/mL, 163.1 U/mg and 277s-¹, respectively. PG is highly specific for the polygalacturonic acid substrate and generated mono-galacturonic acid, products characteristic of exo-PG action. The clarified juices of orange, apple and mango presented an increase in transmittance at 35, 45, 49%, respectively, with reduction of color in 22, 51, 55%, respectively. In this way, the exo-PG of P. janthinellum VI2R3M has interesting biochemical characteristics for application in juice industries. / Pectinases são enzimas em crescente uso no setor industrial como na indústria de sucos, vinhos, alimentos, papel e tecidos. Podem ser produzidas por uma variedade de microrganismos, mas os fungos apresentam maiores vantagens pois se adaptam a grande variedade de substratos, possuem um rápido crescimento e apresentam ampla prevalência no meio ambiente. As pectinases atuam sobre a pectina, que é um dos principais componentes da parede celular de plantas e é rica em ácido galacturônico (GalA). Entre as pectinases, a poligalacturonase (PG) degrada a molécula de pectina atuando internamente e ao acaso na cadeia, liberando oligossacarídeos (endo-PG), ou por ataque da extremidade não redutora da cadeia, liberando monossacarídeos (exo-PG). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi investigar a produção de uma poligalacturonase a partir do fungo Penicillium janthinellum VI2R3M, que foi isolado da Mata Atlântica do Oeste do Paraná, e após, purificar, caracterizar e testar uma possível aplicabilidade. A enzima foi produzida através de cultivo em meio Khanna, em seguida foi purificada através de colunas cromatográficas e sua pureza e massa molecular confirmada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE). Posteriormente, a enzima foi caracterizada bioquimicamente quanto ao pH, temperatura, influência dos íons metálicos, especificidade ao substrato, produtos de hidrólise, peso molecular, parâmetros cinéticos (Km, Vmáx, Kcat) e verificada a aplicação na clarificação de sucos. Uma PG foi purificada após duas etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica (DEAE-Sephadex) e filtração molecular (Sephadex G100). A pureza e massa molecular (102,0 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE. A enzima apresentou atividade máxima em pH 5,0 e na tempertatura de 50 °C, mantendo-se 100% estável a 50 °C por 30 minutos e 80% em pH 3,0 a 5,0 por 24 horas. O íon metálico Mg2+ aumentou a atividade da enzima significativamente. Parâmetros cinéticos, ou seja, o Km, Vmax e Kcat para hidrólise da pectina foram de 2,56 mg/mL, 163,1 U/mg e 277s-1 respectivamente. A PG é altamente específica para o substrato ácido poligalacturônico e gerou ácido mono-galacturônico, produtos característicos da ação de exo-PG. Os sucos clarificados de laranja, maçã e manga apresentaram aumento da transmitância em 35, 45, 49%, respectivamente, com redução da cor em 22, 51, 55%, respectivamente. Dessa forma, a exo-PG de P. janthinellum VI2R3M possui características bioquímicas interessantes para aplicação em indústrias de sucos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.unioeste.br:tede/3979 |
| Date | 28 August 2018 |
| Creators | Pagnonceli, Juliana |
| Contributors | Maller, Alexandre, Maller, Alexandre, Maller, Ana Claudia Paiva Alegre, Kadowaki, Marina Kimiko |
| Publisher | Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 6588633818200016417, 500, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIOESTE, Brasil, Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UNIOESTE, instname:Universidade Estadual do Oeste do Paraná, instacron:UNIOESTE |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 7878055067573953101, 600, 600, 600, -8940439713387849267, 6997636413449754996 |
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