Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is an alphaherpesvirus associated with meningoencephalitis, an important disease of cattle in South America. Differential modified live vaccines that allow differentiation between vaccinated and naturally infected animals have been used in programs for control and eradication of porcine and bovine herpesvirus infections in several countries. Like in other alphaherpesviruses, the enzyme thymidine kinase (TK) and the glycoprotein E (gE) are related with pathogenicity and virulence of BoHV-5. Thus, the present study aimed to produce and characterize BoHV-5 viruses defective in TK and gE genes out of a Brazilian wild-type strain (SV507/99). In the first part of this study, several BoHV-5 clones resistant to brivudin (BVDU), a nucleoside analog which select TK-deficient virus, were selected. One such clone (BoHV-5/R-27) demonstrated to be genetically stable in vitro, and displayed the same kinetics of replication, plaque size and morphology in cell monolayers compared to the parental strain. Moreover, BoHV-5/R-27 was shown to be attenuated for rabbits since no clinical signs were observed after intranasal inoculation. These results demonstrate that BoHV-5 is sensitive to BVDU; BVDU-resistant mutants can be selected, and the BoHV-5/R-27 resistant virus retained its ability to replicate in tissue culture and was attenuated for rabbits. In the second part of the study, three recombinants BoHV-5 strains defective in gE, TK and both genes were constructed using the strain SV507/99 as a background and were characterized in vitro. Homologous recombination in cell culture was used to delete and substitute the entire or part of the coding regions of gE and TK for the green fluorescent protein (GFP) and betagalactosidase (β-gal) genes, respectively. The absence of gE and TK genes was confirmed by immunoblotting and PCR, respectively. In vitro characterization of the recombinant viruses (BoHV-5 gEΔ, BoHV-5 TKΔ and BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrated that the deletions did not affect their kinetics of replication when compared to the parental strain. However, recombinants BoHV-5 gEΔ and BoHV-5 gE/TKΔ
produced smaller plaques than BoHV-5 TKΔ and SV507/99. This study demonstrated the viability of the recombinant BoHV-5 viruses, which can be further used in pathogenesis studies and for vaccine development as well. The third part of this study evaluated the immunogenicity in cattle of two inactivated oil-adjuvanted vaccines containing SV507/99 or BoHV-5 gE/TKΔ infected cell cultures. For this, forty calves (20 animals/group) were vaccinated on days 0 and 22 post-vaccination (pv) and serum samples collected at different time points pv were tested for neutralizing antibodies against the homologous BoHV-5 strain and against several heterologous BoHV-5 and bovine herpesvírus type 1 (BoHV-1) isolates. All vaccinated animals seroconverted after the second vaccination (mean titers of 17.5 for the SV507/99 group and 24.1 for the BoHV-5 gE/TKΔ group), and the neutralizing antibody titers remained up to day 116 pv, showing a gradual reduction. Cross-serology with heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates indicated that both vaccinated groups reacted similarly to the same virus, but with higher magnitude against BoHV-5 isolates. These results demonstrated that the inactivated vaccine using the BoHV-5 gE/TKΔ recombinant induced a satisfactory serological response. Based on the fact that gE can be used as a negative serological marker, this strains can be an alternative as a differential vaccine. In summary, the presented results describe the production and characterization of BoHV-5 strains defective for two genes associated with virulence. The recombinant strains can be used in pathogenesis studies and constitute potential candidate for differential vaccines. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite, uma doença de grande importância em bovinos na América do Sul. Vacinas atenuadas por manipulação genética e contendo marcadores antigênicos que permitem a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente têm sido utilizadas com sucesso no controle e erradicação de infecções por herpesvírus suínos e bovinos em vários países. Como em outros alfaherpesvirus, a enzima timidina quinase (TK) e glicoproteína E (gE) estão relacionados com a patogenicidade e virulência do BoHV-5. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar cepas do BoHV-5 defectivas na TK e gE a partir de uma amostra brasileira (SV507/99). Na primeira parte do estudo foram selecionadas variantes resistentes a brivudin (BVDU), um análogo de nucleosídeo que seleciona vírus defectivos na atividade TK. Um clone viral resistente ao BVDU (BoHV-5/R-27) demonstrou ser geneticamente estável in vitro, replicou com a mesma cinética e produziu placas com diâmetro e morfologia similares às da cepa parental. A atenuação do variante BoHV-5/R-27 foi confirmada pela inoculação intranasal em coelhos, nos quais não produziu enfermidade. Os resultados demonstram que variantes do BoHV-5 resistentes ao BVDU podem ser selecionados e que mantém a capacidade de replicar em cultivo celular e são atenuados para coelhos. Na segunda parte do trabalho, três cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas nos genes da gE, TK e ambos foram construídas a partir da cepa parental SV507/99 e caracterizadas in vitro. A técnica de recombinação homóloga foi utilizada para substituir integral ou parcialmente a região codificante dos genes da gE e TK pelos genes da proteína verde fluorescente (GFP) ou betagalactosidase (β-gal), respectivamente. A deleção das sequências da gE e TK foram confirmadas por immunoblotting e PCR, respectivamente. A caracterização in vitro das cepas recombinantes (BoHV-5 gEΔ; BoHV-5 TKΔ e BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrou que as deleções não alteraram a capacidade de replicação em cultivo celular, embora as cepas BoHV-5 gEΔ e BoHV-5
gE/TKΔ produzissem placas menores do que a cepas BoHV-5 TKΔ e parental. Desta maneira, demonstrou-se que os vírus recombinantes são biologicamente viáveis, podendo ser utilizados em estudo de patogenia ou como candidatos a cepas vacinais. Na terceira parte do estudo foi avaliada a imunogenicidade em bovinos de duas formulações vacinais inativadas oleosas, produzidas a partir de cultivos celulares infectados com a cepa parental (SV507/99) ou recombinante BoHV-5 gE/TKΔ. Para isso, quarenta bovinos (20 animais por grupo) foram vacinados nos dias 0 e 22 pós-vacinação (pv) e amostras de soro, coletadas a diferentes intervalos pós-vacinação, foram testadas para anticorpos neutralizantes contra a cepa homóloga e frente a diferentes isolados de BoHV-5 e herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Todos os animais vacinados soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médio de 17,5 para o grupo SV507/99 e 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKΔ) e os níveis de anticorpos neutralizantes foram detectados até o final do experimento (dia 116 pv), porém com redução gradual. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto, com maior magnitude contra amostras de BoHV-5. Os resultados demonstram que a vacina experimental composta por antígenos do BoHV-5 gE/TKΔ recombinante induziu resposta sorológica em níveis semelhantes ao induzida pela vacina produzida a partir do vírus parental. Dessa forma, e considerando-se a gE como marcador sorológico negativo, essa cepa recombinante se constitui em uma alternativa para possível vacina diferencial. Em resumo, os resultados apresentam a obtenção e caracterização de cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas em dois genes associados com virulência. Essas cepas podem ser utilizadas em estudos de patogênese e, sobretudo, se constituem em candidatos potenciais para a formulação de vacinas diferenciais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4044 |
| Date | 02 March 2009 |
| Creators | Brum, Mário Celso Sperotto |
| Contributors | Weiblen, Rudi, Flores, Eduardo Furtado, Roehe, Paulo Michel, Kreutz, Luiz Carlos, Leite, Fabio Pereira Leivas |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 300, 300, 300, 300, 300, 300, 02776f4b-7154-4d1a-9f55-d68a031b94bc, 44af5755-84f9-448f-965f-5d74f2bdd9ea, fc942c69-bbbf-43f4-a567-55f21b90fd14, 7a581963-8c55-4693-9d0f-2cfebe07be06, 2700d56a-cb01-4915-8552-248ffaf3ea12, 0abbfc40-be3f-46c7-9fb1-a5e95cbcaa83 |
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