Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is an alphaherpesvirus associated with meningoencephalitis, an important disease of cattle in South America. Differential modified live vaccines that allow differentiation between vaccinated and naturally infected animals have been used in programs for control and eradication of porcine and bovine herpesvirus infections in several countries. Like in other alphaherpesviruses, the enzyme thymidine kinase (TK) and the glycoprotein E (gE) are related with pathogenicity and virulence of BoHV-5. Thus, the present study aimed to produce and characterize BoHV-5 viruses defective in TK and gE genes out of a Brazilian wild-type strain (SV507/99). In the first part of this study, several BoHV-5 clones resistant to brivudin (BVDU), a nucleoside analog which select TK-deficient virus, were selected. One such clone (BoHV-5/R-27) demonstrated to be genetically stable in vitro, and displayed the same kinetics of replication, plaque size and morphology in cell monolayers compared to the parental strain. Moreover, BoHV-5/R-27 was shown to be attenuated for rabbits since no clinical signs were observed after intranasal inoculation. These results demonstrate that BoHV-5 is sensitive to BVDU; BVDU-resistant mutants can be selected, and the BoHV-5/R-27 resistant virus retained its ability to replicate in tissue culture and was attenuated for rabbits. In the second part of the study, three recombinants BoHV-5 strains defective in gE, TK and both genes were constructed using the strain SV507/99 as a background and were characterized in vitro. Homologous recombination in cell culture was used to delete and substitute the entire or part of the coding regions of gE and TK for the green fluorescent protein (GFP) and betagalactosidase (β-gal) genes, respectively. The absence of gE and TK genes was confirmed by immunoblotting and PCR, respectively. In vitro characterization of the recombinant viruses (BoHV-5 gEΔ, BoHV-5 TKΔ and BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrated that the deletions did not affect their kinetics of replication when compared to the parental strain. However, recombinants BoHV-5 gEΔ and BoHV-5 gE/TKΔ produced smaller plaques than BoHV-5 TKΔ and SV507/99. This study demonstrated the viability of the recombinant BoHV-5 viruses, which can be further used in pathogenesis studies and for vaccine development as well. The third part of this study evaluated the immunogenicity in cattle of two inactivated oil-adjuvanted vaccines containing SV507/99 or BoHV-5 gE/TKΔ infected cell cultures. For this, forty calves (20 animals/group) were vaccinated on days 0 and 22 post-vaccination (pv) and serum samples collected at different time points pv were tested for neutralizing antibodies against the homologous BoHV-5 strain and against several heterologous BoHV-5 and bovine herpesvírus type 1 (BoHV-1) isolates. All vaccinated animals seroconverted after the second vaccination (mean titers of 17.5 for the SV507/99 group and 24.1 for the BoHV-5 gE/TKΔ group), and the neutralizing antibody titers remained up to day 116 pv, showing a gradual reduction. Cross-serology with heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates indicated that both vaccinated groups reacted similarly to the same virus, but with higher magnitude against BoHV-5 isolates. These results demonstrated that the inactivated vaccine using the BoHV-5 gE/TKΔ recombinant induced a satisfactory serological response. Based on the fact that gE can be used as a negative serological marker, this strains can be an alternative as a differential vaccine. In summary, the presented results describe the production and characterization of BoHV-5 strains defective for two genes associated with virulence. The recombinant strains can be used in pathogenesis studies and constitute potential candidate for differential vaccines. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite, uma doença de grande importância em bovinos na América do Sul. Vacinas atenuadas por manipulação genética e contendo marcadores antigênicos que permitem a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente têm sido utilizadas com sucesso no controle e erradicação de infecções por herpesvírus suínos e bovinos em vários países. Como em outros alfaherpesvirus, a enzima timidina quinase (TK) e glicoproteína E (gE) estão relacionados com a patogenicidade e virulência do BoHV-5. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar cepas do BoHV-5 defectivas na TK e gE a partir de uma amostra brasileira (SV507/99). Na primeira parte do estudo foram selecionadas variantes resistentes a brivudin (BVDU), um análogo de nucleosídeo que seleciona vírus defectivos na atividade TK. Um clone viral resistente ao BVDU (BoHV-5/R-27) demonstrou ser geneticamente estável in vitro, replicou com a mesma cinética e produziu placas com diâmetro e morfologia similares às da cepa parental. A atenuação do variante BoHV-5/R-27 foi confirmada pela inoculação intranasal em coelhos, nos quais não produziu enfermidade. Os resultados demonstram que variantes do BoHV-5 resistentes ao BVDU podem ser selecionados e que mantém a capacidade de replicar em cultivo celular e são atenuados para coelhos. Na segunda parte do trabalho, três cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas nos genes da gE, TK e ambos foram construídas a partir da cepa parental SV507/99 e caracterizadas in vitro. A técnica de recombinação homóloga foi utilizada para substituir integral ou parcialmente a região codificante dos genes da gE e TK pelos genes da proteína verde fluorescente (GFP) ou betagalactosidase (β-gal), respectivamente. A deleção das sequências da gE e TK foram confirmadas por immunoblotting e PCR, respectivamente. A caracterização in vitro das cepas recombinantes (BoHV-5 gEΔ; BoHV-5 TKΔ e BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrou que as deleções não alteraram a capacidade de replicação em cultivo celular, embora as cepas BoHV-5 gEΔ e BoHV-5 gE/TKΔ produzissem placas menores do que a cepas BoHV-5 TKΔ e parental. Desta maneira, demonstrou-se que os vírus recombinantes são biologicamente viáveis, podendo ser utilizados em estudo de patogenia ou como candidatos a cepas vacinais. Na terceira parte do estudo foi avaliada a imunogenicidade em bovinos de duas formulações vacinais inativadas oleosas, produzidas a partir de cultivos celulares infectados com a cepa parental (SV507/99) ou recombinante BoHV-5 gE/TKΔ. Para isso, quarenta bovinos (20 animais por grupo) foram vacinados nos dias 0 e 22 pós-vacinação (pv) e amostras de soro, coletadas a diferentes intervalos pós-vacinação, foram testadas para anticorpos neutralizantes contra a cepa homóloga e frente a diferentes isolados de BoHV-5 e herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Todos os animais vacinados soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médio de 17,5 para o grupo SV507/99 e 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKΔ) e os níveis de anticorpos neutralizantes foram detectados até o final do experimento (dia 116 pv), porém com redução gradual. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto, com maior magnitude contra amostras de BoHV-5. Os resultados demonstram que a vacina experimental composta por antígenos do BoHV-5 gE/TKΔ recombinante induziu resposta sorológica em níveis semelhantes ao induzida pela vacina produzida a partir do vírus parental. Dessa forma, e considerando-se a gE como marcador sorológico negativo, essa cepa recombinante se constitui em uma alternativa para possível vacina diferencial. Em resumo, os resultados apresentam a obtenção e caracterização de cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas em dois genes associados com virulência. Essas cepas podem ser utilizadas em estudos de patogênese e, sobretudo, se constituem em candidatos potenciais para a formulação de vacinas diferenciais.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Vaccines with antigenic markers also known as differential vaccines have been largely used for control and prevention of bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) infection. With this purpose, a Brazilian BoHV-1 isolate (SV56/90) was submitted to deletion of the glycoprotein E (gE) gene for a potential use in vaccines. BoHV-1 gE gene deletion was performed by homologous recombination, being the gE gene replaced by the green fluorescent protein (GFP) gene for selection. Upon co-transfection of MDBK cells with genomic viral DNA plus the GFP-bearing gE-deletion plasmid, three fluorescent recombinant clones were obtained (and nominated as BoHV-1ΔgE). The recombinant viruses formed smaller plaques in MDBK cells yet with similar kinetics and grew to similar titers to those of the parental virus, showing that gE deletion had no deleterious effect on the replication efficiency in vitro. Thirteen calves inoculated intramuscularly (IM) with the recombinant BoHV-1ΔgE developed virus neutralizing (VN) antibodies at day 42pi (titers from 2 to 16), demonstrating his ability to replicate and to induce a serological response in vivo. Furthermore, the serological response induced by the recombinant virus could be differentiated from that induced by wild-type BoHV-1 by the use of an anti-gE antibody ELISA kit. Experiments to determine the safety, immunogenicity and protection were performed with the BoHV-1ΔgE candidate vaccine strain. In the safety test, five three months-old calves were inoculated with approximately 10-100 times the usual vaccine dose (108.5TCID50 per animal). The inoculated animals remained healthy and did not shed virus, confirmed by the absence of virus in nasal secretions and lack of seroconversion by sentinel calves kept in contact. In addition, the recombinant virus was not shed upon dexamethasone administration (at day 42pi) showing the inability of reactivation and/or shedding after attempts of reactivation of latent infection. In the immunogenicity test, calves (8 to 10 months-old) were vaccinated once IM (group I, n=8) or subcutaneously (group II, n=9) with live BoHV-1ΔgE or twice (30 days apart) with inactivated virus plus aluminum hydroxide (group IV, n=13) or MontanideTM Gel 1 (Seppic - group V, n=14). As controls, three animals (group III) were vaccinated once IM with the parental virus. All calves vaccinated with live virus developed VN titers of 2 to 8 (group I, GMT: 2; group II, GMT: 1.65; group III, GMT: 1.65) at day 42pv. Animals of groups IV and V developed VN titers of 2 to 16 (GMT: 2.45) and 2 to 128 (GMT: 3.9), respectively. All calves vaccinated with the BoHV-1ΔgE remained negative in the gE ELISA. In a vaccination-challenge experiment, six calves (three to four-months-old) were vaccinated with live virus (107.3TCID50/animal) and four calves were kept as controls. Forty-seven days after vaccination, the calves were challenged with a heterologous BoHV-1 strain (107.5TCID50/animal) by the intranasal route. Vaccinated animals developed only mild and transient nasal signs comparing with the control calves. Virus shedding by vaccinated animals was also significantly reduced compared to controls. These results demonstrate that the recombinant BoHV-1ΔgE is safe/attenuated, immunogenic for calves both in a live or inactivated, adjuvanted vaccine formulation. Moreover, it induces a humoral response that can be distinguished from that induced by the wild type virus. Thus, the recombinant BoHV-1ΔgE presents suitable properties to be used in vaccine formulations. / Vacinas com marcadores antigênicos também denominadas vacinas diferenciais tem sido amplamente utilizadas no controle e prevenção da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Com este objetivo, uma amostra brasileira de BoHV-1 (SV56/90) foi submetida à deleção do gene da glicoproteína E (gE) para potencial uso em vacinas. A deleção do gene da gE foi realizada por recombinação homóloga, sendo o gene da gE substituído por um marcador para seleção (green fluorescent protein, GFP). Após co-transfecção de plasmídio de deleção e DNA genômico viral em células MDBK, três recombinantes expressando a GFP foram obtidos (e denominados BoHV-1ΔgE). Os vírus recombinantes produziram placas menores em células MDBK, porém com cinética e em títulos semelhantes ao vírus parental, demonstrando que a deleção da gE não afetou negativamente a sua capacidade replicativa in vitro. Treze bezerros inoculados pela via intramuscular (IM) com o recombinante BoHV-1ΔgE desenvolveram anticorpos neutralizantes (títulos entre 2 e 16), demonstrando a sua capacidade replicativa e imunogênica in vivo. Além disso, a resposta sorológica induzida pelo recombinante pode ser diferenciada daquela induzida pelo vírus parental pelo uso de um teste ELISA específico para anticorpos anti-gE. Posteriormente, o vírus recombinante foi submetido a testes de segurança/atenuação, de imunogenicidade e de proteção frente a desafio in vivo. No teste de segurança, cinco bezerros de três meses de idade foram inoculados pela via IM com o recombinante em uma dose aproximadamente 10-100 vezes a dose contida em vacinas comerciais (108,5TCID50 por animal). Os animais inoculados permaneceram saudáveis e não excretaram o vírus, confirmado pela ausência de vírus em secreções nasais e pela ausência de soroconversão em bezerros sentinelas mantidos em contato. O vírus recombinante também não foi excretado após administração de dexametasona (dia 42pi), demonstrando a incapacidade de reativar e/ou ser excretado após tentativa de reativação de infecção latente. No teste de imunogenicidade, bezerros com 8 a 10 meses de idade foram vacinados uma vez pela via IM (grupo I, n=8) ou subcutânea (SC, grupo II, n=9) com o recombinante BoHV-ΔgE viável, ou duas vezes (30 dias de intervalo) com o vírus inativado, conjugado com hidróxido de alumínio (grupo IV, n= 13) ou com MontanideTM Gel 1 (Seppic - grupo V, n=14). Como controle, três animais (grupo III) foram vacinados com o vírus parental (uma dose pela via IM). Todos os bezerros vacinados com o vírus viável desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 (grupo I, GMT: 2; grupo II, GMT: 1,65; grupo III, GMT: 1,65) no dia 42pv. Os demais animais desenvolveram títulos de 2 a 16 (grupo IV, GMT: 2,45) e de 2 a 128 (grupo V, GMT: 3,9). Todos os animais vacinados com o BoHV-1ΔgE permaneceram negativos no teste ELISA anti-gE. No teste de vacinação com desafio, seis bezerros (3-4 meses de idade) foram vacinados com o recombinante BoHV-1ΔgE viável na dose de 107,3TCID50/animal e quatro foram mantidos como controle. No dia 47pv, os animais foram submetidos a desafio com uma cepa heteróloga do BoHV-1 (dose de 107,5TCID50/animal) pela via intranasal. Os animais vacinados desenvolveram sinais clínicos mais brandos e por período mais curto e, excretaram vírus em menores títulos e por menos tempo do que os controles. Esses resultados demonstram que o vírus recombinante BoHV-1ΔgE é seguro/atenuado e imunogênico para bezerros, tanto na forma replicativa quanto na forma inativada. Além disso, induz resposta sorológica capaz de ser diferenciada daquela induzida pelo vírus parental. Sendo assim, o BoHV-1ΔgE apresenta propriedades adequadas para ser usado em formulações vacinais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study describes an investigation of the attenuation/virulence and immunogenicity of a recombinant BoHV-5, a candidate vaccine strain. The recombinant BoHV-5gE/TKΔ was constructed out of a Brazilian BoHV-5 strain (SV507/99) and contains deletions in glycoprotein E (gE) gene as antigenic marker - and thymidine kinase (TK) gene for attenuation. In Chapter 1, we investigated the attenuation and immunogenicity of the recombinant in calves. Eighty-to-ninety days old calves (n=6) inoculated intranasally (IN) with the recombinant virus (titer of 107.5 TCID50) showed no clinical signs, and shed low titers of virus in nasal secretions. On day 30 post-infection (pi), all animals had neutralizing antibodies against BoHV-5, in titers from 4 to 8 and remained negative for antibodies to gE. Administration of dexamethasone (Dx) to four of these calves at day 42 pi (0.1mg/kg/day during 5 days) did not result in virus shedding or increase in antibody titers, indicating lack of viral reactivation. In a second experiment, intramuscular immunization (IM) of calves with 8 months of age (n=9) with the recombinant virus (107.5 TCID50/animal) did not result in virus shedding or clinical signs. Vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (PV) and remained negative for gE antibodies. Finally, 21 calves (approximately 10 months old) were vaccinated IM with the recombinant virus (107.3 TCID50). All vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 16 at day 30pv. A boost vaccination performed on those animals at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Serum samples of all animals remained negative for gE antibodies. Serum samples from vaccinated animals showed cross-neutralizing activity against nine field isolates of BoHV-5 and eight of BoHV-1. Chapter 2 describes an investigation of the immunogenicity and protection conferred by the recombinant virus against homologous (BoHV-5) and heterologous challenge (BoHV-1). A group of nine calves seronegative for BoHV-5 were vaccinated IM in a dose of 107.5 TCID50 of the recombinant virus and eight animals were maintained as non vaccinated controls. All vaccinated animals seroconverted 14 days postvaccination (pv), with neutralizing antibody titers from 2 to 4. At day 42 post-vaccination (pv), the vaccinated animals and controls were challenged by IN instillation of BoHV-5 or BoHV-1 isolates. After challenge, the length and magnitude of virus shedding was reduced in vaccinated animals compared to controls in both groups (challenged with BoHV-1 and BoHV-5). The vaccinated animals did not show systemic, respiratory or neurological clinical signs after challenge. Furthermore, the control animals challenged with BoHV-5 (n=4) developed severe neurological disease and were euthanized in extremis between days 13 and 14 post-challenge (pd). The challenge resulted in a strong and rapid anamnestic response in vaccinated animals, inducing neutralizing titers higher than in control animals. Antibodies to gE were detected only after challenge in both vaccinated and controls calves. These results indicate that recombinant BoHV-5 gE/TKΔ is an adequate candidate for a vaccine strain, with an antigenic marker, since it is attenuated and immunogenic for calves and provides homologous and heterologous (BoHV-1) protection. / O presente trabalho descreve a atenuação/virulência e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) candidata a cepa vacinal. O recombinante BoHV-5gE/TKΔ foi construído a partir da cepa brasileira SV507/99 e contém deleções nos genes da glicoproteína E (gE) como marcador antigênico - e da enzima timidina quinase (TK), para atenuação. No capítulo 1, investigou-se a atenuação e imunogenicidade do recombinante em bezerros. Bezerros com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5 TCID50) não apresentaram sinais clínicos, e excretaram títulos baixos de vírus nas secreções nasais. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, permanecendo soronegativos para a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) foram vacinados com o recombinante (107,3 TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativo para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. O capítulo 2 relata uma investigação sobre a imunogenicidade e proteção conferida pelo vírus recombinante frente a desafio homólogo (BoHV-5) e heterólogo (BoHV-1). Para isso, nove bezerros soronegativos para o BoHV-5 foram vacinados pela via intramuscular com uma dose de 107,5DICC50 do vírus recombinante e oito animais foram mantidos como controle. Todos os animais vacinados soroconverteram aos 14 dias pós-vacinação (pv), apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 2 e 4. No dia 42 pós-vacinação (pv), os animais vacinados e os controles foram desafiados pela inoculação intranasal (IN) de isolados de BoHV-5 ou de BoHV-1. Após o desafio, a excreção de vírus pelos animais vacinados foi reduzida em comparação com os não vacinados, nos dois grupos (desafiados com BoHV-1 e BoHV-5). Os animais vacinados também não apresentaram sinais clínicos sistêmicos, respiratórios ou neurológicos pós desafio. Por outro lado, os animais controles inoculados com o BoHV-5 (n=4) desenvolveram doença neurológica severa e foram eutanasiados in extremis entre os dias 13 e 14 pós-desafio (pd). O desafio provocou uma resposta anamnéstica intensa e rápida nos animais vacinados, induzindo títulos neutralizantes superiores aos animais não vacinados. Anticorpos contra a gE foram detectados apenas após o desafio, tanto nos vacinados quanto nos controles. Esses resultados indicam que o recombinante BoHV-5 gE/TKΔ é um candidato adequado a cepa vacinal com marcador antigênico, pois é atenuado e imunogênico para bezerros, confere proteção homóloga e também contra o BoHV-1.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was isolated for the first time in 1991 and since then it has been associated with significant economic losses to the pig industry worldwide. Although vaccination against PRRSV is widely used, an important advance would be the development of marker vaccines allowing serologic discrimination between vaccinated and naturally infected animals. The present study aimed to identify immunogenic and conserved regions dispensable to viral replication in different PRRSV proteins, which could be used as negative serologic markers in a new generation of liveattenuated vaccines. A fine mapping of B-cell linear epitopes in different PRRSV proteins by Pepscan is presented in the first part of this thesis. The results indicated the presence of several B-cell linear epitopes in the non-structural protein 2 (Nsp2) and in all structural proteins encoded by PRRSV, which were consistently recognized by antibodies raised in pigs experimentally infected with a North American strain of the virus (NVSL97-7895). The Nsp2 was found to harbor the highest frequency of immunodominant epitopes (n=18) when compared to structural proteins. In the structural proteins, epitopes consistently recognized by immune sera were located in all studied proteins. Overall, the highest degree of immunogenicity and conservation was exhibited by two epitopes identified in the C-terminal end of the M protein (ORF6). The antibodies recognizing the immunodominant epitopes of each protein were detected as early as days 7 to 15 post-infection (p.i.) and remained detectable until the end of the experiment (day 90 p.i). Based on their immunodominance and level of amino acid (aa) conservation, two target epitopes were selected to serve as serological marker candidates in each of the following PRRSV proteins: Nsp2, GP3 and M. These epitopes were deleted in the wild-type cDNA infectious clone (FL-12) by site-directed mutagenesis. The results of this study are presented in the second part of this thesis. A Nsp2 mutant virus (FLdNsp2/44) was successfully rescued following RNA transfection in MARC 145 cells. This epitope deletion mutant fulfilled the requirements for a differential vaccine virus such as efficient growth in vitro and in vivo and induction of active seroconversion as measured by a commercial ELISA kit associated with the absence of a marker-specific peptide-ELISA response in 100% (n=15) of the vaccinated animals. In vitro and in vivo characterization of the mutant virus clearly showed that removal of a 15-mer Nsp2 epitope had no effect on the immunogenicity, growth properties or virulence when compared to the wild type virus. On the other hand, deletions of previously identified peptide marker candidates within GP3 and M genes were shown to be lethal for virus viability in vitro. Alternatively, by substitution of 5aa at a time within a M peptide marker candidate, a viable mutant virus could be recovered although it still resulted in a positive marker virus. In summary, our results provide proof of concept that PRRSV marker vaccines can be developed using such methodology. Taken together, these data indicate that the combination of a mutant virus carrying a deletion of an immunodominant epitope and the corresponding peptide ELISA represents an attractive approach for the development of PRRSV differential modified-live vaccines. / O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) foi isolado pela primeira vez em 1991 e, desde então, tem sido associado a perdas significativas para a suinocultura mundial. Apesar da vacinação contra o PRRSV ser amplamente utilizada, um grande avanço seria alcançado com a elaboração de vacinas diferenciais que permitam a discriminação sorológica entre animais vacinados e naturalmente infectados. O presente estudo teve como objetivo a identificação de regiões imunogênicas, conservadas e dispensáveis a replicação viral, em diferentes proteínas do PRRSV, que pudessem ser utilizadas como marcadores sorológicos negativos em uma nova geração de vacinas atenuadas. Na primeira parte desta tese estão apresentados os resultados de um mapeamento de epítopos lineares de linfócitos B em diferentes proteínas do PRRSV, pelo uso da tecnologia de Pepscan. Os resultados indicam a presença de diversas regiões imunodominantes na proteína não estrutural 2 (Nsp2) e em todas as proteínas estruturais do vírus. Essas regiões foram consistentemente reconhecidas pelo soro de suínos experimentalmente infectados com uma cepa norte-americana do PRRSV (NVSL97-7895). A maior freqüência de epítopos imunodominantes foi identificada na Nsp2 (n=18) e o mais alto grau de imunogenicidade e nível de conservação de aminoácidos foi observado em dois epítopos identificados na extremidade carboxi-terminal da proteína M (ORF6). Anticorpos reagentes com epítopos imunodominantes de cada proteína foram detectados inicialmente entre os dias 7-15 pós-infecção (pi), permanecendo em altos títulos até o final do experimento (dia 90 pi). Com base na imunodominância e nível de conservação de amino ácidos (aa) das seqüências mapeadas, dois epítopos alvos foram selecionados como candidatos a marcadores sorológicos negativos em cada uma das proteínas Nsp2, Gp3 e M. Esses epítopos foram então deletados em um clone infeccioso de cDNA (FL12) por mutagênese sítio-direcionada. Os resultados desses experimentos encontram-se descritos na segunda parte da tese. Um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante da Nsp2 (FLdNsp2/44) foi obtido após transfeccção de RNA viral em células MARC145. A caracterização in vitro e in vivo do vírus mutante demonstrou que a remoção dos 15 aa da Nsp2 não produziu efeito sobre a imunogenicidade, replicação ou virulência quando comparado ao vírus parental. Além disso, observou-se indução de soroconversão contra o PRRSV em animais infectados, detectada pelo uso de um teste ELISA comercial. Por outro lado, não foi detectada resposta humoral específica contra a região deletada nos animais imunizados com o FLdNsp2/44, conforme resultados de um teste ELISA contendo como antígeno um peptídeo sintético correspondente a seqüência removida. Por outro lado, deleções dos epítopos previamente identificados na Gp3 e proteína M foram letais à viabilidade viral in vitro. Alternativamente, um outro vírus mutante foi gerado pela substituição de 5 aa do epítopo identificado na proteína M, embora a alteração de resíduos não tenha sido suficiente para eliminar a imunogenicidade da região. Em resumo, os resultados do presente estudo se constituem em uma prova de conceito no sentido do desenvolvimento de vacinas diferenciais contra o PRRSV. A utilização de um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante, associado com um teste de ELISA baseado no peptídeo sintético correspondente a região deletada, representam uma alternativa para o desenvolvimento de vacinas diferenciais atenuadas contra o PRRSV.