Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is the etiologic agent of neurological disease in calves. The use of recombinant differential vaccines have been proposed against the disease. This dissertation relates an investigation on the attenuation in calves of three BoHV-5 recombinants with deletions in the coding regions of glycoprotein E (BoHV-5gEΔ), thymidine kinase (BoHV-5TKΔ) or both (BoHV-5gETKΔ) for potential use in vaccines. Each of the four groups of calves was inoculated intranasally with one of the mutants or the wild type virus (wt [SV507/99]) and monitored thereafter. The calves inoculated with wt virus shed virus for an average of 12.3 days (106.8DICC50/mL), in the group BoHV-5gEΔ for 11 days (105.1DICC50/mL), in the group BoHV-5TKΔ for 9.6 (105.9DICC50/mL) and in the group BoHV-5gETKΔ for 6.2 days (104.7DICC50/mL). No respiratory or systemic signals were observed in animals inoculated with the recombinants, while two calves of the wt group presented neurologic disease and were euthanyzed in extremis. Seroconversion was verified on the 32 days post-inoculation (pi) in all animals of group wt and BoHV-5gEΔ, while 2 and 4 animals of the groups BoHV-5TKΔ e BoHV-5gETKΔ seroconverted, respectively. Aiming at reactivating latent infection, on the 42 days pi, animals were treated with dexamethasone (Dx). Reactivation was achieved in wt group while groups BoHV-5gE and BoHV-5TKΔ shed virus only for one or two days. No virus shedding was verified on group BoHV-5gETKΔ. Euthanasia was executed 30 days later and brain sections were collected for DNA viral detection. Viral DNA was detected in the brain of wt inoculated animals and in restricted brain sections in the BoHV-5gEΔ group. These results demonstrated that mutants are fully attenuated for calves during acute infection and present a reduced ability to establish and/or reactivate latent infection after Dx administration. Therefore these recombinants may be useful in vaccine formulations. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é o agente de doença neurológica grave em bovinos. A utilização de vacinas recombinantes tem sido preconizada para o controle da infecção pelo BoHV-5. O objetivo do presente trabalho foi investigar a patogenia, em bezerros, de três recombinantes do BoHV-5, com deleções nos genes da glicoproteína E (BoHV-5gEΔ), da enzima timidina quinase (BoHV-5TKΔ) ou ambos (BoHV-5gETKΔ) para uso potencial em vacinas. Para isso, quatro grupos de bezerros com 80 a 90 dias de idade foram inoculados pela via intranasal (IN) com um dos recombinantes ou com a cepa parental (SV507/99) e monitorados nos dias seguintes à inoculação. Os animais inoculados com o vírus parental (SV507/99) excretaram vírus por um período médio de 12,3 dias (título máximo 106,8DICC50/mL), no grupo BoHV-5gEΔ por 11 dias (105,1DICC50/mL), no grupo BoHV-5TKΔ por 9,6 dias (105,9DICC50/mL) e no grupo BoHV-5gETKΔ por 6,2 dias (104,7DICC50/mL). Os animais inoculados com os vírus recombinantes não desenvolveram sinais respiratórios ou sistêmicos importantes; dois animais do grupo SV507/99 apresentaram doença neurológica e foram sacrificados in extremis. No dia 32 pós-inoculação (pi), todos os animais inoculados com o SV507/99 e BoHV-5gEΔ haviam soroconvertido (títulos de 4 a 8), enquanto nos grupos BoHV-5TKΔ e BoHV-5gETKΔ, dois e quatro animais soroconverteram (títulos de 2 a 8), respectivamente. No dia 42 pi, realizou-se a administração de dexametasona (Dx) na tentativa de reativar a infecção latente. Após a administração de Dx, os animais dos grupos BoHV-5gEΔ e BoHV-5TKΔ excretaram vírus por um ou dois dias. Os animais do grupo BoHV-5gETKΔ não excretaram vírus, enquanto a excreção pelos animais do grupo inoculado com o vírus parental foi mais duradoura e em maiores títulos. No dia 30 pós-Dx, os animais foram submetidos à eutanásia para a coleta do encéfalo para a pesquisa de DNA latente por PCR. Não foi detectado DNA viral no encéfalo dos animais inoculados com o BoHV-5TKΔ e BoHV-5gETKΔ, enquanto no grupo SV507/99 foi detectado em todos os animais nas diferentes secções. Dentre os animais inoculados com o recombinante BoHV-5gEΔ, foi verificada uma distribuição de DNA viral restrita, com detecção em apenas uma secção (córtex anterior, ponte ou tálamo) em três animais. Esses resultados demonstram que os recombinantes foram atenuados durante a infecção aguda; apresentaram uma capacidade reduzida de estabelecer infecção latente e não foram facilmente reativados pela administração de Dx. Com isso, constituem-se em potenciais candidatos a cepas vacinais.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesviruses 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are genetic and antigenic closely related pathogens of cattle, historically associated with respiratory/genital and neurological disease, respectively. This thesis reports the genomic and phylogenetic analyzes based on glycoproteins C (gC) and D (gD) genes of BoHV-1 and BoHV-5. Initially, the differentiation between BoHV-1 and BoHV-5 was performed by a differential PCR based on 5 gC gene. Then, a molecular analysis based on the 3 region of the gC gene of 45 BoHV isolates from Brazil, Uruguay and Argentina (1981-2009) was described. The phylogenetic tree reconstruction provided a clear distinction between BoHV-1 and BoHV-5, and BoHV-1 into subtypes BoHV-1.1 and BoHV-1.2. The levels of nucleotide (nt) similarity ranged from 99.1 to 100% among BoHV-1 sequences (n=12); 96.2-100% among BoHV-5 sequences (n=32); and 77.7-90.3% between BoHV-1 and BoHV-5 sequences. A transmembrane domain of 24 amino-acid (aa) and the putative cytoplasmic tail of 8 aa were also identified. In addition, a phylogenetic study was performed to investigate genetic divergences at the 3 region of gD gene of respiratory/genital BoHV-1 (n=7), neurological BoHV-1 (n=7) and neurological BoHV-5 (n=7) isolates, and whether these differences would be associated with the respective neurological presentation. The phylogenetic reconstruction allowed a clear differentiation of BoHV-1 (n=14) and BoHV-5 (n=7), but BoHV-1 isolates from neurological disease grouped within BoHV-1 branch. The nt and aa similarity levels were on average 98.3% among BoHV-1; 97.8% and 95.8% among BoHV-5; 73.7% and 64.1% between viral species. These results indicate that both genes revealed a high conserved 3 region within each species and a less conserved region between BoHV-1 and BoHV-5. The phylogenetic analyzes allowed differentiation of BoHV-1 and BoHV-5 species, and even subtypes grouped in distinct branches in the 3 gC gene-based study, indicating that this region represents a better choice for phylogenetic subgrouping. So, it was concluded that these genome regions represent a suitable target for phylogenetic classification of BoHV-1 and BoHV-5 isolates, and, perhaps, for understanding evolutionary relationships. However, no conclusion of a possible association of genetic differences with phenotypes could be drawn. / Bovine herpesviruses 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are genetic and antigenic closely related pathogens of cattle, historically associated with respiratory/genital and neurological disease, respectively. This thesis reports the genomic and phylogenetic analyzes based on glycoproteins C (gC) and D (gD) genes of BoHV-1 and BoHV-5. Initially, the differentiation between BoHV-1 and BoHV-5 was performed by a differential PCR based on 5 gC gene. Then, a molecular analysis based on the 3 region of the gC gene of 45 BoHV isolates from Brazil, Uruguay and Argentina (1981-2009) was described. The phylogenetic tree reconstruction provided a clear distinction between BoHV-1 and BoHV-5, and BoHV-1 into subtypes BoHV-1.1 and BoHV-1.2. The levels of nucleotide (nt) similarity ranged from 99.1 to 100% among BoHV-1 sequences (n=12); 96.2-100% among BoHV-5 sequences (n=32); and 77.7-90.3% between BoHV-1 and BoHV-5 sequences. A transmembrane domain of 24 amino-acid (aa) and the putative cytoplasmic tail of 8 aa were also identified. In addition, a phylogenetic study was performed to investigate genetic divergences at the 3 region of gD gene of respiratory/genital BoHV-1 (n=7), neurological BoHV-1 (n=7) and neurological BoHV-5 (n=7) isolates, and whether these differences would be associated with the respective neurological presentation. The phylogenetic reconstruction allowed a clear differentiation of BoHV-1 (n=14) and BoHV-5 (n=7), but BoHV-1 isolates from neurological disease grouped within BoHV-1 branch. The nt and aa similarity levels were on average 98.3% among BoHV-1; 97.8% and 95.8% among BoHV-5; 73.7% and 64.1% between viral species. These results indicate that both genes revealed a high conserved 3 region within each species and a less conserved region between BoHV-1 and BoHV-5. The phylogenetic analyzes allowed differentiation of BoHV-1 and BoHV-5 species, and even subtypes grouped in distinct branches in the 3 gC gene-based study, indicating that this region represents a better choice for phylogenetic subgrouping. So, it was concluded that these genome regions represent a suitable target for phylogenetic classification of BoHV-1 and BoHV-5 isolates, and, perhaps, for understanding evolutionary relationships. However, no conclusion of a possible association of genetic differences with phenotypes could be drawn.

Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an important pathogen of cattle and causes significant economic losses to livestock industry. Monoclonal antibodies (mAbs) represent useful tools for diagnostic and research purposes. Most mAbs produced against BoHV-1 are directed to glycoprotein gC (gC), an abundant and immunodominant envelope antigen. In the present study, antigens of a BoHV-1 strain defective in the gene coding for glycoprotein C was used to immunize BALB/c mice to produce mAbs with other protein specificities. After fusion and selection of 54 hybridomas resistant to the selective medium HAT, three hybridomas secreting mAbs directed to BoHV-1 antigens were obtained (1F1, 2H4, 4D7). The mAbs belong to the IgG2a isotype and reacted in an indirect fluorescent antibody assay (IFA) and indirect immunoperoxidase staining (IPX) of BoHV-1-infected cells at dilutions up to 1:640 (culture supernatant) and 1:20,000 (ascitic fluid). The three mAbs tested reacted with 14 isolates of respiratory and/or genital disease and with 17 isolates of neurological disease and showed variable level of neutralizing activity against the most of these isolates. The protein specificity of the mAbs could not be determined, because none of them reacted with viral proteins in western immunoblot. On the other hand, the three mAbs reacted in IFA with viral antigens of BoHV-1 and BoHV-5 mutant strains defective on gC, gE, gI and US9 genes, demonstrating that they are directed against other viral antigens. Because the high reaction titer and the wide range of reactivity, these mAbs have potential use in diagnostics techniques. Also, these mAbs may be useful to map conserved neutralizing epitopes in the envelope glycoproteins / O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais patógenos de bovinos e causa perdas significativas para a bovinocultura. Anticorpos monoclonais (AcMs) se constituem em importantes ferramentas para o diagnóstico e pesquisa em diversos aspectos da biologia desse agente. A maioria dos AcMs produzidos contra o BoHV-1 são direcionados contra a glicoproteína C (gC), um antígeno abundante e imunodominante do envelope viral. No presente trabalho, antígenos de uma cepa do BoHV-1 defectiva no gene da gC foram utilizados para a imunização de camundongos visando a produção de AcMs com outras especificidades protéicas. Após fusão e seleção de 54 clones resistentes ao meio seletivo HAT, foram obtidos três hibridomas secretores de AcMs contra antígenos do BoHV-1 (1F1, 2H4, 4D7). Os AcMs pertenceram ao isotipo IgG2a e reagiram em diluições de até 1:640 (sobrenadante de cultivo) e 1:20.000 (fluído ascítico) em testes de imunofluorescência indireta (IFA) e imunoperoxidase indireta (IPX). Os três AcMs reagiram na IFA com 14 isolados de doença respiratória e/ou genital e com 17 isolados de doença neurológica, e apresentaram atividade neutralizante em níveis variáveis contra a grande maioria desses isolados. A especificidade protéica dos AcMs não foi determinada, pois nenhum deles reagiu com proteínas virais na técnica de Western blot. Por outro lado, os três AcMs reagiram na IFA contra antígenos virais de cepas do BoHV-1 e BoHV-5 com deleção dos genes que codificam as proteínas gC, gE, gI e US9, demonstrando que são direcionados contra outros antígenos virais. Pelo seu alto título de reação e pelo amplo espectro de reatividade, esses AcMs possuem aplicação potencial em técnicas diagnósticas. Esses AcMs também podem ser úteis para o mapeamento de epitopos neutralizantes conservados nas glicoproteínas do envelope

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) the agent of meningoencephalitis in cattle - is an important pathogen of cattle in South America and efforts have been made to produce safer and more effective vaccines. This dissertation relates an investigation of the virulence in rabbits of three BoHV-5 recombinants, vaccine candidates, defective in the glycoprotein E (BoHV-5gEΔ), thymidine kinase (BoHV-5TKΔ) and both genes (BoHV-5gEΔTKΔ). To this, four groups of eight rabbits each were inoculated intranasally with each recombinant or the parental strain (SV507/99) and monitored thereafter. At day 42 post inoculation (pi) the inoculated animals were submitted to dexamethasone (Dx) administration to reactivate latent infection. At day 70 pi, all animals were euthanized and the brain was collected for investigation of latent viral DNA by PCR. Rabbits inoculated with the parental virus shed virus between days 2 and 8 pi and all rabbits (n=8) developed neurological disease and died or were euthanized in extremis, between days 7 and 13 pi. Among the animals inoculated with the recombinants, viral shedding was detected between days 2 and 10 pi, in 7 out of 8 rabbits of the BoHV-5gEΔ group, in 6 out of 8 rabbits of the BoHV-5TKΔ group and in 3 out of 8 of the BoHV-5gEΔTKΔ group. In spite of variable levels of virus shedding, all rabbits inoculated with the recombinants seroconverted, developing virus-neutralizing antibodies in titers from 2 to 256 at day 42 pi. The rabbits inoculated with the parental virus showed a wide distribution of the virus in their brains, including the olfactory bulbs, cortices, medulla oblongata, pons, midbrain and thalamus. Three out of eight rabbits inoculated with the recombinant BoHV-5gEΔ developed neurological signs at days 10 and 15pi. A more restricted virus distribution, confined mainly to cerebral cortices and thalamus was detected in the brain of these animals. Rabbits inoculated with the recombinants BoHV-5TKΔ (n=8) or BoHV-5gEΔTKΔ (n=8) remained healthy during the experiment. Dx administration to rabbits inoculated with the three recombinants at day 42 pi did not result in viral reactivation, as demonstrated by lack of seroconversion or virus shedding. Nevertheless, viral DNA was detected in the trigeminal ganglia or olfactory bulbs of all these animals at day 28pDx, demonstrating they were latently infected. These results showed that the three recombinants were able to establish latent infection yet they were not easily reactivated by Dx administration. In summary, the recombinants BoHV-5TKΔ and BoHV-5gEΔTKΔ are attenuated for rabbits and constitute potential vaccine candidates. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), agente da meningoencefalite herpética bovina, possui grande importância na América do Sul e tem motivado pesquisas para o desenvolvimento de vacinas eficazes e seguras. Essa dissertação relata a investigação da virulência em coelhos de três recombinantes do BoHV-5, candidatos vacinais, contendo deleções nos genes da glicoproteína E (gE) (BoHV-5gEΔ), da enzima timidina quinase (TK) (BoHV-5TKΔ) e deleção dupla nos genes da gE e TK (BoHV-5gEΔTKΔ). Para isso, quatro grupos de oito coelhos cada foram inoculados pela via intranasal com um dos recombinantes ou com a cepa parental (SV507/99) e monitorados nos dias seguintes à inoculação. No dia 42 pós-inoculação (pi) realizou-se a administração de dexametasona (Dx) para reativar a infecção latente e no dia 70 pi a eutanásia para a coleta do encéfalo para a pesquisa de DNA latente por PCR. Os coelhos inoculados com o vírus parental (SV507/99) excretaram vírus nas secreções nasais entre os dias 2 e 8 pós-inoculação (pi), e todos (n=8) desenvolveram doença neurológica e morreram ou foram submetidos à eutanásia in extremis entre os dias 7 e 13 pi. Excreção viral entre os dias 2 e 10 pi também foi detectada em 7 de 8 coelhos inoculados com o BoHV-5gEΔ; 6 de 8 inoculados com BoHV-5TKΔ e 3 de 8 inoculados com BoHV-5gEΔTKΔ. Apesar dos níveis variáveis de excreção viral, os animais inoculados com os três recombinantes soroconverteram, apresentando anticorpos neutralizantes em títulos entre 2 e 256 no dia 42 pi. Nos animais inoculados com o vírus parental, o vírus foi detectado amplamente disseminado no encéfalo, incluindo o bulbo olfatório, córtices, bulbo, ponte, mesencéfalo e tálamo. Dentre os animais inoculados com o recombinante BoHV-5gEΔ, três desenvolveram doença neurológica, nos dias 10 e 15 pi. Uma distribuição viral restrita aos córtices e tálamo foi detectada no encéfalo desses animais. Os coelhos inoculados com os recombinantes BoHV-5TKΔ (n=8) e BoHV-5gEΔTKΔ (n=8) permaneceram saudáveis. A administração de dexametasona (Dx) no dia 42 pi não resultou em reativação da infecção por nenhum dos recombinantes, demonstrada por ausência de soroconversão ou excreção viral em secreções. Entretanto, o DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo ou no bulbo olfatório de todos esses animais no dia 28 pDx (70dpi), demonstrando o estabelecimento da infecção latente. Esses resultados demonstram que os recombinantes são capazes de estabelecer a infecção latente, mas não são facilmente reativados pela administração de Dx. Em resumo, os recombinantes BoHV-5TKΔ e BoHV-5gEΔTKΔ são atenuados para coelhos constituindo-se, assim, em candidatos vacinais em potencial.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study describes aspects of the pathogenesis of bovine herpesvirus-5 (BoHV-5) infection in goats and rabbits. The study performed in goats was aimed at investigating the susceptibility of this species to BoHV-5 infection, due its potential role as a virus reservoir. Young goats were inoculated intranasally with three Brazilian BoHV-5 isolates (SV-507, G1; SV-609, G2; and EVI-88, G3) and monitored thereafter regarding to virus shedding, clinical signs and antibody response. The acute infection was characterized by virus shedding in nasal secretions for up to 14 days post-inoculation (pi) in titers reaching up to 105.97 TCID50/mL, mild respiratory signs and seroconversion. At day 60 pi, two animals of each group were euthanized for tissue collection to search viral DNA. The remaining animals were submitted to dexamethasone (Dx) administration to reactivate latent infection. Dx treatment resulted in virus reactivation in 75% (9/12) animals, as ascertained by virus shedding (8/12), and/or seroconversion (3/12). Latent viral DNA was detected in the trigeminal ganglia (TG) and/or in the main olfactory bulb (MOB) of all goats euthanized at days 60 pi and 40 post-dexamethasone. These results demonstrate that goats are susceptible to BoHV-5 acute and latent infection and may shed virus upon reactivation of latency. Thus, this species should be considered a potential reservoir for BoHV-5 in areas where goats and cattle are raised in close contact. The second experiment was aimed at investigating the role of the olfactory pathway in the transport of BoHV-5 to the brain of rabbits. For this, thirty days-old rabbits had the MOB surgically removed and were subsequently inoculated intranasally (IN) or conjunctivally (IC) with the strain SV-507 of the BoHV-5. Intranasal inoculation resulted in neurological disease in 100% of the control animals (with MOB), with clinical signs starting between days 5 and 10 pi; in the group submitted to MOB ablation only one animal (9.1%) developed neurological signs (started at day 17 pi). Following IC inoculation 10/12 (83.3%) control rabbits (with MOB) developed neurological disease with clinical signs starting between days 11 and 20 (mean 15.3 days). Furthermore, 10/12 rabbits lacking the MOB also developed neurological disease starting between days 9 and 15 pi (mean 12.5 days). These results demonstrate that both the olfactory and the trigeminal pathways may be used by BoHV-5 to invade the brain of rabbits after experimental infection. The transport by the olfactory pathway is faster and more efficient, while the trigeminal transport is slower and less efficient. These results add important information to the knowledge about the neuropathogenesis of alphaherpesvirus infection. / O presente estudo descreve aspectos da patogenia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) em caprinos e coelhos. O estudo em caprinos teve como objetivo investigar a susceptibilidade da espécie ao BoHV-5, devido ao seu possível papel como reservatório do vírus. Para isto, caprinos jovens foram inoculados pela via intranasal (IN) com três isolados brasileiros do BoHV-5 (SV-507, G1; SV-609, G2; e EVI-88, G3) e monitorados nos aspectos virológicos, clínicos e sorológicos. A fase aguda caracterizou-se por excreção viral em secreções nasais por um período de até 14 dias pós-inoculação (pi) em títulos de até 105,97 DICC50/mL, sinais respiratórios brandos e soroconversão. No dia 60 pi, dois animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia para a coleta de tecidos e pesquisa de DNA viral. Os animais restantes foram submetidos à administração de dexametasona (Dx), na tentativa de reativar a infecção latente. A administração de Dx resultou em reativação da infecção latente em 75% (9/12) animais, detectada pela excreção viral (8/12) e/ou soroconversão (3/12). O DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) e/ou no bulbo olfatório (BO) de todos os animais eutanasiados nos dias 60 pi e 40 pós-dexametasona. Esses resultados demonstram que caprinos são susceptíveis a infecção aguda e latente pelo BoHV-5 e podem excretar vírus durante a reativação da infecção. Portanto, essa espécie pode ser considerada um potencial reservatório do BoHV-5 em áreas onde caprinos e bovinos são criados conjuntamente. O segundo experimento teve como objetivo investigar a importância da via olfatória na invasão do encéfalo de coelhos pelo BoHV-5. Para isto, coelhos recém desmamados foram previamente submetidos à ablação cirúrgica do BO e inoculados pela via IN ou conjuntival (IC) com a cepa SV-507 do BoHV-5. A inoculação IN resultou no desenvolvimento de doença neurológica em 100% dos animais controle (com BO), com início dos sinais clínicos entre os dias 5 e 10 pi. No grupo submetido à ablação do BO apenas um animal (9,1%) apresentou sinais neurológicos (início dia 17 pi). Após a inoculação IC, 10/12 (83,3%) coelhos controle (com BO) desenvolveram doença neurológica com o início dos sinais entre os dias 11 e 20 (média 15,3 dias); 10/12 coelhos (83,3%) sem o BO também desenvolveram a doença neurológica, com os sinais iniciando entre os dias 9 e 15 pi (média 12,5 dias). Esses resultados demonstram que tanto a via olfatória como a via trigeminal podem ser utilizadas pelo BoHV-5 para invadir o SNC de coelhos após infecção experimental. Porém, o transporte pela via olfatória é mais rápido e mais eficiente enquanto que a via trigeminal atua como via de acesso mais lento e menos eficiente. Esses resultados são importantes para um melhor conhecimento sobre a neuropatogênese das infecções pelos alfaherpesvírus.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_bianca_siedler.pdf: 968152 bytes, checksum: 4210f5ec4c0f10354b8e411cff54f4e5 (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / Mucosal immune system represents the initial barrier against many pathogens, including bovine herpesviruses (BoHV). After infection of mucous membranes, mainly nasal and genital, these viruses disseminate locally followed by viremia and neural spread. Innate defense mechanisms along with adaptive immunity confer protection to mucosal surfaces. In this context, secretory IgA (sIgA) plays an essential role in the mucosal humoral immunity, conferring protection to these body surfaces through different mechanisms, including viral neutralization. This class of antibody predominates in the vaginal mucosa of cattle playing an important role in the local defense against infections. Considering the importance of this infection route in herpesviruses pathogenesis, there is a growing interest in the development of vaccines that provide mucosal immunity against these viruses. In the present study, eight cows were divided in two groups (G1 and G2) and inoculated intravaginally with inactivated BoHV-5 associated with recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (rLTB) and xanthan (G1) and inactivated BoHV-5 associated with xanthan (G2). Local and systemic humoral immune response (IgA and IgG) induced after inoculation was measured by indirect ELISA. An increment in the levels of IgA and IgG was detected in sera, nasal and genital mucosa of all the immunized animals. Furthermore, the relative expression of interleukins 2 and 13 (IL-2 and IL-13) was investigated by real-time PCR indicating an increased mRNA expression of these cytokines in leukocytes collected from animals immunized with the experimental vaccine. These results demonstrate that the experimental intravaginal BoHV-5 vaccine induced a local and systemic immune response in cattle. The results also corroborated the immunostimulant activity of the rLTB in mucosal membranes and confirmed the use of xanthan as a delivery system for intravaginal vaccines. Our data also reinforce the importance of this route for administration of vaccines focused on providing local protection against pathogens. / O sistema imune de mucosa representa a barreira inicial frente a diversos patógenos que utilizam estas superfícies como porta de entrada no organismo, como é o caso dos herpesvírus bovinos (BoHV). Estes vírus utilizam as mucosas, principalmente nasal e genital, como ponto inicial de replicação, seguida de disseminação local, viremia sistêmica e disseminação neuronal. Mecanismos inatos de defesa em cooperação direta com mecanismos adaptativos conferem proteção a estas mucosas. A IgA secretora (sIgA) representa um papel fundamental na imunidade humoral destes locais, conferindo proteção a estas superfícies através de distintos mecanismos, incluindo a neutralização viral. Este anticorpo predomina na mucosa vaginal de bovinos, sendo essencial na defesa local frente a patógenos de transmissão genital. Devido a grande importância das vias mucosas na transmissão dos BoHV, torna-se evidenciado o interesse no desenvolvimento de vacinas que propiciem imunidade de mucosa contra estes agentes etiológicos. No presente estudo, oito fêmeas bovinas foram divididas em dois grupos (G1 e G2) e inoculadas por via intravaginal com BoHV-5 inativado associado à subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) e xantana (G1) e BoHV-5 inativado associado a xantana (G2). A resposta humoral (IgA e IgG) local e sistêmica induzida nos animais inoculados foi mensurada através do teste de ELISA indireto. A vacina avaliada demonstrou-se capaz de incrementar os níveis de IgA e IgG no soro e nas mucosas nasal e vaginal dos bovinos imunizados. A expressão relativa das interleucinas 2 e 13 (IL-2 e IL-13) foi avaliada através da técnica de real time RT-PCR, a partir dos leucócitos dos animais vacinados, resultando em aumento na expressão de mRNA destas citocinas nos animais inoculados com a vacina experimental. Estes dados comprovam a capacidade da vacina de aplicação intravaginal em bovinos de estimular uma resposta imune local e sistêmica, além de corroborar a atividade imunoestimulante em mucosas da rLTB e também validar a utilização da xantana como sistema de entrega de vacinas de aplicação intravaginal. Portanto, esta via de administração de vacinas torna-se uma alternativa interessante, principalmente quando se objetiva gerar proteção local contra patógenos que utilizam as superfícies mucosas como porta de entrada no organismo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus types 1 and 5 (BoHV-1, BoHV-5) are genetically and antigenic related viruses and have been associated with important economic losses to the cattle industry. The aim of this Thesis was to perform the molecular identification of BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The first part describes the identification of 40 herpesviruses isolated from different clinical specimens and syndromes in central-southern Brazil, Argentina and Uruguay (1987 2006). The differentiation between BoHV-1 and BoHV-5 was performed by examining the size of the amplification product of a glycoprotein C gene-based PCR, designed for a low homology region of the gene. BoHV-1 isolates (n=16) were identified in cases of respiratory disease (n=3), vulvovaginitis and/or balanoposthitis (n=3), in semen of healthy bulls (n=5) and in cases of neurological disease (n=5). Samples identified as BoHV-5 (n=24) were isolated predominantly from cases of neurological disease (n=21), but also from semen of healthy bulls (n=2) and from a spleen of a calf with systemic disease (n=1). These results show that both BoHV-1 and BoHV-5 are not strictly associated with their respective diseases; yet are frequently involved in clinical conditions otherwise attributed to the other virus type. These findings also reinforce the need of correctly identifying the herpesvirus isolates as to better understand their pathogenesis and epidemiology. In the second part, it is reported the characterization of five Brazilian BoHV-1 isolates associated with neurological disease, an unusual finding. All five samples were isolated from the brain of cattle presenting neurological disease, yet histological evidences of meningoencephalitis were not observed in three cases. The isolated viruses were identified as BoHV-1 by a glycoprotein C gene-based PCR able to differentiate BoHV-1 from BoHV-5. The identity of the isolates was confirmed by nucleotide sequencing of the amplicons and by restriction analysis of PCR products from another gC region. Monoclonal antibody binding and cross-neutralization assays with BoHV-1 and BoHV-5 antisera showed a typical BoHV-1 antigenic profile. Inoculation of rabbits with these five BoHV-1 isolates did not result in neurological disease, contrasting with fatal meningoencephalitis produced by BoHV-5. Thus, the involvement of BoHV-1 in neurological disease of cattle is more frequent than previously reported, indicating the need for fast and precise means of differentiating it from BoHV-5. Likewise, the potential role of BoHV-1 in neurological disease in cattle should be further investigated. / Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1, BoHV-5) são agentes geneticamente e antigenicamente relacionados que causam grandes prejuízos econômicos à bovinocultura. O objetivo desta tese foi o de realizar a identificação e diferenciação molecular de isolados de BoHV-1 e BoHV-5. Na primeira parte, foi relatada a identificação de 40 amostras de BoHV isoladas de diferentes casos clínicos na região Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai entre 1987 e 2006. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi realizada pelo uso de um PCR para uma região de baixa homologia do gene da glicoproteína C, o que permitiu a diferenciação entre os tipos virais pelo tamanho do amplicon. As amostras identificadas como BoHV-1 (n=16) foram isoladas de doença respiratória (n=3), balanopostite e/ou vulvovaginite (n=3), do sêmen de touros saudáveis (n=5) e de casos doença neurológica (n=5). As amostras identificadas como BoHV-5 (n=24) foram, em sua maioria, isoladas de doença neurológica (n=21), mas também do sêmen de touros saudáveis (n=2) e do baço de um bezerro com doença sistêmica (n=1). Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 não estão estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e que podem estar envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro tipo viral. Esses achados também reforçam a necessidade da correta identificação dos isolados de herpesvírus para um melhor conhecimento da sua patogenia e epidemiologia. Na segunda parte do trabalho, foram caracterizados cinco isolados de BoHV-1 provenientes de casos de doença neurológica. Esses vírus foram isolados do encéfalo de bovinos que apresentavam sinais neurológicos. Entretanto, evidências histológicas de meningoencefalite não foram observadas em três dos cinco casos. Os isolados foram identificados como BoHV-1 pela utilização de um PCR direcionado para o gene da gC. A identidade dos isolados foi confirmada pelo sequenciamento do amplicon e também por um segundo PCR para outra região do gene da gC, seguido de análise de restrição enzimática do amplicon. A caracterização antigênica com anticorpos monoclonais e testes de soroneutralização cruzada demostraram um perfil típico de BoHV-1. Esses cinco isolados também foram inoculados em coelhos, nos quais não produziram doença neurológica. Esses resultados demostram que o envolvimento de BoHV-1 em doença neurológica em bovinos é mais frequente do que o relatado anteriormente, evidenciando a necessidade de uma precisa diferenciação entre os tipos virais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation reports the standardization of a monoclonal antibody (MAb)-based immunoenzymatic test (ELISA) for detection of antibodies to bovine herpesvírus types 1 and/or 5 (BoHV-1 and BoHV-5). The initial steps involved the determination of the most suitable MAb, the appropriate dilutions of viral antigen and test sera; and the cut-off value of the assay. After standardization, the ELISA was validated by testing 506 cattle serum samples previously tested for neutralizing antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 by virus neutralizing (VN) assay. Comparing to the VN for BoHV-1 antibodies, the ELISA presented sensitivity and specificity of 96.6% and 98.3%, respectively. Positive and negative predictive values were 97.6%, the concordance between the tests was 97.6% and the coefficient of correlation k (kappa) was 0.95, demonstrating an excellent correlation. Comparing to the VN for BoHV-5 antibodies, the ELISA presented 94.3% of sensitivity, 97.9% of specificity, 97.1% of positive predictive value, 95.9% negative predictive value, concordance of 96.4% and kappa coefficient of 0.92. These results demonstrate that the ELISA presents suitable specificity and sensitivity to be used for individual and herd serological diagnosis of BoHV-1 and BoHV-5, thus, representing an alternative for VN assays and imported ELISA kits. / Essa dissertação relata a padronização de um teste imunoenzimático do tipo ELISA, com base em anticorpo monoclonal (AcM), para a detecção de anticorpos séricos que reagem contra herpesvírus bovino tipos 1 e/ou 5 (BoHV-1, BoHV-5). Inicialmente, determinou-se o AcM mais adequado para a sensibilização das placas, as diluições apropriadas do antígeno e dos soros-teste e o ponto de corte do ensaio. Após a padronização, o ensaio foi validado testando-se 506 amostras de soro bovino, previamente testadas para anticorpos neutralizantes contra o BoHV-1 e/ou BoHV-5 pela técnica de soroneutralização (SN). Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-1, o teste de ELISA apresentou sensibilidade e especificidade de 96,6% e 98,3%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram de 97,6%, a concordância foi de 97,6% e o índice de correlação (kappa) entre os testes foi de 0,95, o que indica uma excelente concordância. Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-5, o ELISA apresentou 94,3% de sensibilidade; 97,9% de especificidade; 97,1% de valor preditivo positivo e 95,9% de valor preditivo negativo. Para o BoHV-5, a concordância entre os testes foi de 96,4% e o índice de correlação foi de 0,92, também excelente. Esses resultados demonstram que o teste padronizado apresenta sensibilidade e especificidade adequados para o diagnóstico sorológico das infecções pelo BoHV-1 e BoHV-5 em nível individual e de rebanho. Dessa forma, o ensaio pode se constituir em alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA importados.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 258964 bytes, checksum: 135e6be4766beec15d819dd30575f517 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is the etiological agent of the bovine meningoencephalitis that presents high morbidity in young bovine. Due to the similarity in the morphology of the virion, cytopathic effect in cell culture and antigenic properties, the BoHV-5 was classified erroneously as BoHV-1 in the past. BoHV-1 is responsible for respiratory and genital diseases, however the disease caused by BoHV-5 presents neurological clinical signs. This virus has been considered a variant of the same agent (BoHV-1) with neuropathogenic characteristics. Comparative studies among isolates of BoHV-5 revealed 97% of proteic similarity. However, the amino-terminal region of the most abundant glycoprotein of the viral envelope, the gC, differs substantially. This glycoprotein is involved in the initial interactions of the virus with the cellular surface besides of presenting as target for antibodies with neutralizing activities. This study aimed at to select an isolate of BoHV-5, among 5 isolates collected in outbreaks in different properties in Brazil, presenting higher antigenicity in vaccinated animals. Vaccines were formulated using isolates ISO9898292, SV507, SV163, 1807 and EVI145 and administered to 5 groups of 10 sheeps, which have received two intramuscular doses on days 0 and 21. Collections of blood were accomplished for analysis of production of antibodies by virus-neutralization and attendance of possible clinical signs to the 63rd day after the first vaccination. Antibodies titers averages ranged from 6,85 and 14,92 on the day 0 before the first vaccination. Antibody peak were on day 14, ranged from 4,50 (isolated ISO9898292) to 138,63 (isolated SV163). A second peak was observed 14 days after the booster ranged from 7,77 (ISO9898292) to 1017,54 (1807). In the 42nd day after the booster, it was observed titers variation from 3,84 (ISO9898292) to 305,97 (1807). The discrepancy among titers of antibody of each group of animals suggests a smaller antigenicity of isolated ISO9898292 in relation to the others, demonstrating a possible variation among the isolates, what results in antigenic differences. All isolates, with exception to ISO9898292, were effective in the induction of antibodies. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é o agente etiológico da menigoencefalite bovina que apresenta alta morbidade em bovinos jovens. Devido à similaridade na morfologia do virion, efeito citopático na cultura de células e propriedades antigênicas, o BoHV-5 foi classificado erroneamente como herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Este vírus é responsável por doenças respiratórias e genitais, porém a doença causada pelo BoHV-5 apresenta sinais clínicos neurológicos, com isso o vírus foi considerado uma variante do mesmo agente com características de neuropatogenicidade. Estudos comparativos entre isolados de BoHV-5 revelaram 97% de similaridade protéica. No entanto, a região amino terminal da glicoproteína mais abundante do envelope viral, a gC, difere substancialmente. Esta glicoproteína está envolvida nas interações iniciais do vírus com a superfície celular, além de se apresentar como alvo para anticorpos com atividades neutralizantes. Este estudo objetivou selecionar um isolado do vírus BoHV-5, entre 5 isolados coletados em surtos da doença em diferentes propriedades, que confira maior antigenicidade em animais vacinados. As vacinas foram formuladas com os isolados ISO9898292, SV507, SV163, 1807 e EVI145 e administradas a 5 grupos de 10 ovelhas, as quais receberam duas doses vacinais por via intramuscular nos dias 0 e 21. Foram realizadas coletas de sangue para análise de produção de anticorpos por virusneutralização e acompanhamento de possíveis sinais clínicos até o 63º dia após a primo-vacinação. Foram observados dois picos na curva de anticorpos, o primeiro no dia 14, após a vacinação, onde os títulos de anticorpos variaram entre 4,50 (isolado ISO9898292) a 138,62 (isolado SV163). O segundo pico foi observado 14 dias após a revacinação onde os títulos variaram entre 7,77 (ISO9898292) a 1017,54 (1807). No 42º dia após a revacinação observou-se variação de título entre 3,84 (ISO9898292) a 305,97 (1807). A discrepância entre as médias de título de anticorpo de cada grupo de animais sugere uma menor antigenicidade do isolado ISO9898292 em relação aos demais, demonstrando uma possível variação entre os isolados, o que resulta em diferenças antigênicas. Todos os isolados, com exceção ao ISO9898292, mostraram-se eficazes na indução de anticorpos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study describes an investigation of the attenuation/virulence and immunogenicity of a recombinant BoHV-5, a candidate vaccine strain. The recombinant BoHV-5gE/TKΔ was constructed out of a Brazilian BoHV-5 strain (SV507/99) and contains deletions in glycoprotein E (gE) gene as antigenic marker - and thymidine kinase (TK) gene for attenuation. In Chapter 1, we investigated the attenuation and immunogenicity of the recombinant in calves. Eighty-to-ninety days old calves (n=6) inoculated intranasally (IN) with the recombinant virus (titer of 107.5 TCID50) showed no clinical signs, and shed low titers of virus in nasal secretions. On day 30 post-infection (pi), all animals had neutralizing antibodies against BoHV-5, in titers from 4 to 8 and remained negative for antibodies to gE. Administration of dexamethasone (Dx) to four of these calves at day 42 pi (0.1mg/kg/day during 5 days) did not result in virus shedding or increase in antibody titers, indicating lack of viral reactivation. In a second experiment, intramuscular immunization (IM) of calves with 8 months of age (n=9) with the recombinant virus (107.5 TCID50/animal) did not result in virus shedding or clinical signs. Vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (PV) and remained negative for gE antibodies. Finally, 21 calves (approximately 10 months old) were vaccinated IM with the recombinant virus (107.3 TCID50). All vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 16 at day 30pv. A boost vaccination performed on those animals at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Serum samples of all animals remained negative for gE antibodies. Serum samples from vaccinated animals showed cross-neutralizing activity against nine field isolates of BoHV-5 and eight of BoHV-1. Chapter 2 describes an investigation of the immunogenicity and protection conferred by the recombinant virus against homologous (BoHV-5) and heterologous challenge (BoHV-1). A group of nine calves seronegative for BoHV-5 were vaccinated IM in a dose of 107.5 TCID50 of the recombinant virus and eight animals were maintained as non vaccinated controls. All vaccinated animals seroconverted 14 days postvaccination (pv), with neutralizing antibody titers from 2 to 4. At day 42 post-vaccination (pv), the vaccinated animals and controls were challenged by IN instillation of BoHV-5 or BoHV-1 isolates. After challenge, the length and magnitude of virus shedding was reduced in vaccinated animals compared to controls in both groups (challenged with BoHV-1 and BoHV-5). The vaccinated animals did not show systemic, respiratory or neurological clinical signs after challenge. Furthermore, the control animals challenged with BoHV-5 (n=4) developed severe neurological disease and were euthanized in extremis between days 13 and 14 post-challenge (pd). The challenge resulted in a strong and rapid anamnestic response in vaccinated animals, inducing neutralizing titers higher than in control animals. Antibodies to gE were detected only after challenge in both vaccinated and controls calves. These results indicate that recombinant BoHV-5 gE/TKΔ is an adequate candidate for a vaccine strain, with an antigenic marker, since it is attenuated and immunogenic for calves and provides homologous and heterologous (BoHV-1) protection. / O presente trabalho descreve a atenuação/virulência e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) candidata a cepa vacinal. O recombinante BoHV-5gE/TKΔ foi construído a partir da cepa brasileira SV507/99 e contém deleções nos genes da glicoproteína E (gE) como marcador antigênico - e da enzima timidina quinase (TK), para atenuação. No capítulo 1, investigou-se a atenuação e imunogenicidade do recombinante em bezerros. Bezerros com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5 TCID50) não apresentaram sinais clínicos, e excretaram títulos baixos de vírus nas secreções nasais. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, permanecendo soronegativos para a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) foram vacinados com o recombinante (107,3 TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativo para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. O capítulo 2 relata uma investigação sobre a imunogenicidade e proteção conferida pelo vírus recombinante frente a desafio homólogo (BoHV-5) e heterólogo (BoHV-1). Para isso, nove bezerros soronegativos para o BoHV-5 foram vacinados pela via intramuscular com uma dose de 107,5DICC50 do vírus recombinante e oito animais foram mantidos como controle. Todos os animais vacinados soroconverteram aos 14 dias pós-vacinação (pv), apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 2 e 4. No dia 42 pós-vacinação (pv), os animais vacinados e os controles foram desafiados pela inoculação intranasal (IN) de isolados de BoHV-5 ou de BoHV-1. Após o desafio, a excreção de vírus pelos animais vacinados foi reduzida em comparação com os não vacinados, nos dois grupos (desafiados com BoHV-1 e BoHV-5). Os animais vacinados também não apresentaram sinais clínicos sistêmicos, respiratórios ou neurológicos pós desafio. Por outro lado, os animais controles inoculados com o BoHV-5 (n=4) desenvolveram doença neurológica severa e foram eutanasiados in extremis entre os dias 13 e 14 pós-desafio (pd). O desafio provocou uma resposta anamnéstica intensa e rápida nos animais vacinados, induzindo títulos neutralizantes superiores aos animais não vacinados. Anticorpos contra a gE foram detectados apenas após o desafio, tanto nos vacinados quanto nos controles. Esses resultados indicam que o recombinante BoHV-5 gE/TKΔ é um candidato adequado a cepa vacinal com marcador antigênico, pois é atenuado e imunogênico para bezerros, confere proteção homóloga e também contra o BoHV-1.