Orientador: Jose Francisco Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:48:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_JanainaAparecidadeOliveira_D.pdf: 285480 bytes, checksum: 4c39c1efe89bca6b4e60413ccebce99d (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dawood_FawziAhmedMoustafa_LD.pdf: 3019449 bytes, checksum: d4a52f58543ba38520a688aaebf412d1 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed / Tese (livre-docencia) - Univer / Livre-Docente em Imunologia

Resumo: Uma ADAM e uma proteina com aproximadamente 750 aminoacidos de comprimento e com multidominios, que incluem o pro-dominio, o dominio metaloprotease, o dominio desintegrina, o dominio rico em cisteina, o dominio semelhante a fator de crescimento epidermal (EGF-like), a regiao ransmembranica e a cauda citoplasmatica. A proteina ADAM23 (MDC3), dentro do seu dominio metaloprotease, nao possui o sitio ativo de aminoacidos para a ligacao de zinco, o qual e critico para a atividade proteasica. E altamente expressa no encefalo, mas e detectada apenas fracamente ou nao detectada em outros tecidos. Neste rabalho foram expressos satisfatoriamente os dominios recombinantes da proteina ADAM23 desintegrina e metaloprotease+desintegrina fusionados a GST em bacterias E. coli cepa DH5ƒ¿, mas so foi possivel purificar a proteina recombinante GST-desintegrina. Ja a proteina recombinante 6-His-desintegrina+rico em cisteina foi expressa mais significativamente em bacterias E. coli cepa BL21(DE3)STAR em comparacao om a cepa BL21(DE3)pLysS, e sua purificacao ocorreu de forma apropriada. A imunizacao de camundongos Balb/c com a proteina recombinante GST-desintegrina nao mostrou-se satisfatoria, enquanto a imunizacao com a proteina recombinante 6- His-desintegrina+rico em cisteina levou a producao de anticorpos policlonais especificos para ADAM23. Foi realizada uma fusao entre os esplenocitos de camundongo imunizado e celulas de mieloma, levando a obtencao de hibridomas. Apenas um hibridoma demonstrou-se secretor de anticorpos monoclonais especificos para ADAM23, entretanto nao apresentou estabilidade ompativel com a producao ilimitada e reprodutivel de anticorpos monoclonais.

A digoxina é um medicamento usado para tratar distúrbios cardíacos, com janela terapêutica muito estreita. Para combater seu efeito tóxico, fragmentos Fab do anticorpo policlonal anti-digoxina estão disponíveis comercialmente. Nosso objetivo foi a obtenção de variantes de fragmentos Fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina usando a tecnologia phage display, que permite gerar fragmentos de anticorpos de alta afinidade e especificidade. Uma biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-digoxina foi construída no vetor pComb3X a partir do RNA total do hibridoma anti-digoxina. Seis clones foram isolados, todos com sequência idêntica na cadeia pesada. A cadeia leve apresentou 2 clones idênticos, um pseudogene e um clone com um aminoácido distinto no CDR2. Quatro clones apresentando variações na sequência do framework1 da cadeia leve foram expressos como fragmentos Fab solúveis. Todos apresentaram ligação à digoxina-BSA por ELISA e Western blotting. A ligação específica do anticorpo também foi confirmada pelo BIAcore, que permitiu ranqueamento entre os clones. / Digoxin is a pharmaceutical used in the control of cardiac dysfunction. Its therapeutic window is very narrow. To counteract the toxic effect, polyclonal anti-digoxin Fab fragments are commercially available. Our goal was to obtain variants of monoclonal anti-digoxin Fab fragments by phage display technology, which allows the generation of high affinity and specificity antibody fragments. Anti-digoxin Fab fragments combinatorial library was constructed into pComb3X vector from total RNA of anti-digoxin hybridoma. Six clones were isolated and the heavy chain presented the same sequence. For the light chain, 2 clones were identical, one was a pseudogene and other one presented a distinct amino acid in the CDR2. Four clones presenting variations in the framework 1 were induced to express soluble Fab fragments, all positive for anti-digoxin binding in ELISA assays and Western blotting. The specific binding of the antibody was further confirmed by BIAcore, which allowed ranking of the clones.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-06T12:53:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / CAPES / O vírus da dengue (DENV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, apresentando quatro sorotipos denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. No Brasil, a infecção pelo DENV-4 ressurgiu em 2010, após 31 anos, expondo a população ao alto risco de desenvolvimento da dengue grave, devido à co-circulação dos quatro sorotipos. Nesse contexto, os anticorpos monoclonais (AcM) apresentam-se como uma ferramenta importante devido à sua potencial aplicação como ferramenta biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi a produção e caracterização de AcM contra DENV-4. A metodologia para a produção de AcM foi desenvolvida por Köhler e Milstein (1975). Resumidamente, os animais de experimentação foram hiperimunizados com antígeno viral DENV-4, obtidos a partir da multiplicação do vírus em células de cultura C6/36, e subsequente concentração e precipitação com polietilenoglicol 8000. A triagem dos sobrenadantes dos hibridomas para reatividade ao DENV-4 foi realizada pelo Ensaio Imunoenzimático (ELISA), e a caracterização dos AcM foi realizada pelas técnicas de ELISA, Dot-Blot, Imunofluorescência Indireta (IFI), Western-Blot. Um total de dez hibridomas foram obtidos e os AcM produzidos foram denominados A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1, H12. Os AcM apresentaram diferentes perfis de reatividade frente aos diversos testes de detecção antigênica, demonstrando um reconhecimento direcionado principalmente para prM. Em conclusão, este estudo mostra o potencial de utilização dos AcM produzidos como insumo biotecnológico; sejam em estudos a respeito do vírus e sua patogênese, sejam em uma possível aplicação como ferramenta imunodiagnóstica. / Dengue virus (DV) is an arbovirus belonging to family Flaviviridae, genus Flavivirus, with four serotypes named DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. In Brazil, the infection by DENV-4 reemerged in 2010 after 31 years, exposing the population at high risk for developing severe diseases because of the co-circulation of the four serotypes. The monoclonal antibodies (AcM) are important tools due to its potential application in biotechnology. The aim of this work was to produce and to characterize of AcM against DENV-4. The methodology to produce AcM was developed by Köhler and Milstein (1975). Briefly, experimental animals were hyperimmunized with DENV-4 viral antigen obtained to virus multiplication in C6/36 culture cells and subsequent concentration and precipitation with polyethylene glycol 8000. ELISA test was performed to screen hybridoma supernatants for reactivity to DENV-4, and the characterization of AcM was performed by ELISA, Indirect Immunofluorescence (IFI), Dot-Blot and Western-Blot techniques. A total of ten hybridomas were obtained producing AcM named A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1 and H12. AcM showed different reactivity profiles in the tests, showing a dominant recognition to prM. In conclusion, this study shows the potential use of AcM produced as biotechnology tool; to study the virus and its pathogenesis, or a possible application in immunodiagnostic assays.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissDF.pdf: 699670 bytes, checksum: 3b6ce911fe1da5141ad8e34545247e79 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the last two decades mammalian cell cultures have been broadly used for the industrial production of pharmaceutical, proteins, in particular the monoclonal antibodies by cultures of murine hybrid cells (hybridoma). The development of bioprocess for industrial scale of monoclonal antibodys (MAbs) depends on the determination and optimization of several physiological and metabolic parameters. In this work are shown preliminary development results of the bioprocess for production of three MAbs for blood typing through the ABO system, with is of great interest for Brazilian public health. Experiments with three lineages of murine hybridomas which were able to secret three different immunoglobulins with specificity to ABO human blood antigens were accomplished in Spinner flasks using RPMI 1640 medium and fetal bovine serum (FBS) in concentrations of 20 and 10 % vv, temperature of 37 ºC and pH 6.8 7.4 .The three hybridomas showed very different growth patterns in these culture medium The cultivation with 20 % v/v of FBS as much as the cultivation with cells adapted to 10 % v/v FBS showed the necessity of a better balance of the amino acids formulation in the culture medium in order to improve the specific maximum grow rate (µmáx) and maximum cells density (CXmáx). / Nas últimas duas décadas o cultivo de células animais tem sido amplamente utilizado para a produção industrial de proteínas de interesse farmacêutico em particular de anticorpos monoclonais, através do cultivo de células híbridas murinas (hibridomas). O desenvolvimento de bioprocessos de alta produtividade em larga escala de produção de anticorpos monoclonais (MAbs monoclonal antibodys) depende da determinação e otimização de vários parâmetros fisiológicos e metabólicos dos hibridomas. Neste trabalho são apresentados dados preliminares para o desenvolvimento de um bioprocesso de produção de três MAbs para tipagem sanguínea pelo sistema ABO, de grande interesse para a saúde pública Brasileira. Experimentos com três linhagens de hibridomas murinos capazes de secretar imunoglobulinas com especificidade a antígenos eritrocitários do sistema sanguíneo ABO humano foram realizados em frascos Spinner usando meio RPMI 1640 e soro fetal bovino (SFB) em concentrações de 20 e 10 % v/v, temperatura de 37 ºC e pH 6,8 7,4. Os três hibridomas mostraram características de crescimento celular bem diferenciadas nesse meio de cultura. Tanto os cultivos com 20 % v/v de SFB como os cultivos com células adaptadas a 10 % v/v SFB revelaram a necessidade de balanceamento de aminoácidos no meio para melhorar a velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx) e densidade máxima de células (CXmáx).

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scuro_LorenSemionatto_M.pdf: 980651 bytes, checksum: f54e323b2050cb528e7e829af26086ad (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi a obtenção e caracterização de anticorpos monoclonais contra a IL6 humana recombinante (hr) para serem empregados em ensaios imunoenzimáticos do tipo ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) de detecção da IL6 humana nativa, presente em fluídos biológicos de pacientes portadores de quadros onde os níveis de IL6 encontram-se elevados, ou então produzida por monócitos humanos e murinos ativados in vitro. Dois grupos de hibridomas (1A6 e 3B1) secretores de anticorpos monoclonais anti-IL6 foram obtidos pela fusão de células de mieloma da linhagem SP2 Ag14/0 com esplenócitos de camundongos BALB/c, previamente imunizados com a IL6 humana recombinante. Esses hibridomas foram selecionados com base em sua reatividade com a hrIL6, através de ensaios do tipo ELISA indireto. As imunoglobulinas (Igs) monoclonais produzidas pelos hibridomas dos dois grupos são do isotipo IgG1 Kappa e foram purificadas de líquidos ascíticos e dos sobrenadantes de cultura por cromatografia de afinidade. As proteínas purificadas foram conjugadas com biotina para uso em ensaios de ELISA de captura da hrIL6, de modo a se identificar um ou mais pares de anticorpos adequados a esse tipo de teste, bem como para definir a sensibilidade de detecção da citocina. O par de anticorpos monoclonais 3B1E4 x 1A6F10-biotinilado se mostrou mais promissor nos ensaios de ELISA, detectando a citocina recombinante entre 8 e 512 ng/mL, liberando densidades óticas mais elevadas. Todos os anticorpos monoclonais (AcMos) anti IL6 estudados foram capazes de neutralizar a atividade biológica da citocina em ensaios empregando o hibridoma B13.9, uma célula dependente de IL-6 para seu crescimento. Finalmente, o par de hibridomas anti IL6 3B1E4 e 1A6F10 foi estudado quanto às suas principais características de cultivo: crescimento, produção in vitro dos anticorpos, consumo de glicose e produção de lactato e amônia. O seqüênciamento da porção N-terminal do par 3B1E4 e 1A6F10 revelou que as cadeias leves dos dois anticorpos apresentam seqüência idêntica de aminoácidos. Porém, a análise dos dez resíduos de aminoácidos presentes na região variável das cadeias pesadas resultou em seqüências completamente distintas nos dois monoclonais, sendo um forte indício de diferença nos sítios de ligação ao antígeno dos anticorpos estudados / Abstract: In the present study we have developed monoclonal antibodies against human recombinant (hr) IL6, for the use in ELISA assays to detect the human native IL6 present in biological fluid of patients or in supernatant of activated human and rodent monocytes. Two families of hibridomas (1A6 and 3B1) secreting MAb against-IL6 were obtained from the fusion of mieloma cells from SP2 Ag14/0 lineage with spleen cells from BALB/c mice, previously immunized with human recombinant IL6. Those hibridomas were selected on the basis of their reactivity with the hrIL6, through an ELISA indirect assay. The monoclonal immunoglobulins (Igs) produced by these hibridomas are from IgG1 Kappa isotype and were purified from ascitic fluid and culture supernatant by affinity chromatography. The purified proteins from the ascitic fluid were conjugated with biotin for the use in ELISA hrIL6 capture assay, to identify one or more pairs of antibodies appropriated to this kind of test, as well to define the sensibility of cytokine detection. The pair of MAbs 3B1E4 x 1A6F10-biotinilates was shown promising in ELISA assays, detecting the recombinant cytokine between 8 and 512 ng/mL, liberating elevated optical densities. All of the a-IL6 MAbs studied were capable to neutralize the biological activity of the cytokine in attempt employing the hibridoma B13.9 IL-6 dependent. Finally, the pair of hibridomas a-IL6 3B1E4 and 1A6F10 was studied as regards his main cultivation characteristics: growth, MAb production in vitro, lactate and ammonia production and glucose consumption. The N-Terminal portion sequence of 3B1E4 and 1A6F10 revealed that both light-chains present identical amino acid sequence. However, the analysis of the ten amino acid residues present in variable region of heavy-chains resulted in completely distinct sequences in both antibodies, being a strong indication of difference in their ability to recognize the antigen / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A digoxina é um medicamento usado para tratar distúrbios cardíacos, com janela terapêutica muito estreita. Para combater seu efeito tóxico, fragmentos Fab do anticorpo policlonal anti-digoxina estão disponíveis comercialmente. Nosso objetivo foi a obtenção de variantes de fragmentos Fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina usando a tecnologia phage display, que permite gerar fragmentos de anticorpos de alta afinidade e especificidade. Uma biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-digoxina foi construída no vetor pComb3X a partir do RNA total do hibridoma anti-digoxina. Seis clones foram isolados, todos com sequência idêntica na cadeia pesada. A cadeia leve apresentou 2 clones idênticos, um pseudogene e um clone com um aminoácido distinto no CDR2. Quatro clones apresentando variações na sequência do framework1 da cadeia leve foram expressos como fragmentos Fab solúveis. Todos apresentaram ligação à digoxina-BSA por ELISA e Western blotting. A ligação específica do anticorpo também foi confirmada pelo BIAcore, que permitiu ranqueamento entre os clones. / Digoxin is a pharmaceutical used in the control of cardiac dysfunction. Its therapeutic window is very narrow. To counteract the toxic effect, polyclonal anti-digoxin Fab fragments are commercially available. Our goal was to obtain variants of monoclonal anti-digoxin Fab fragments by phage display technology, which allows the generation of high affinity and specificity antibody fragments. Anti-digoxin Fab fragments combinatorial library was constructed into pComb3X vector from total RNA of anti-digoxin hybridoma. Six clones were isolated and the heavy chain presented the same sequence. For the light chain, 2 clones were identical, one was a pseudogene and other one presented a distinct amino acid in the CDR2. Four clones presenting variations in the framework 1 were induced to express soluble Fab fragments, all positive for anti-digoxin binding in ELISA assays and Western blotting. The specific binding of the antibody was further confirmed by BIAcore, which allowed ranking of the clones.

O diagnóstico da infecção por ETEC é baseada na detecção dos seus principais fatores de virulência, as toxinas termo-lábil e termo-estável, através de métodos de biologia molecular ou imunossorológicos. A tecnologia de anticorpos recombinantes permite a obtenção de moléculas com baixo custo, afinidades e especificidades desejáveis, através da clonagem dos domínios variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, fusionados a um ligante flexível que permite a correta interação entre os domínios e a preservação do sítio de ligação ao antígeno. Este estudo teve como objetivo a construção de um fragmento variável em cadeia única (scFv), a partir de hibridomas produtores de anticorpo monoclonal anti-LT, seguida da sua produção em células bacterianas. Um fragmento variável em cadeia única com 723 pb foi obtido, sendo expresso em cepa de Escherichia coli como uma proteína com peso molecular aparente de 30 kDa. Após purificação em cromatografia de afinidade a Ni2+ e renaturação, o scFvLT foi capaz de reconhecer a toxina LT por ELISA de captura e Immunodot, porém não foi capaz de reconhecer as subunidades da toxina LT, por Immunoblotting, nem de neutralizar sua atividade citopática em células adrenais Y1. / Heat-labile (LT) and heat-stable (ST) toxins are the main ETEC\'s virulence factors and infection diagnosis is based on their detection by molecular biology or immunoserological methods. The advances on antibody biotechnology provide alternatives to obtain low cost antibodies with desirable affinities and specificities by cloning immunoglobulin\'s heavy and light variable domains (HV and LV) as a single-chain fusion interspaced by a flexible linker, which allowing the correct interaction between the domains and preserving the antigen-binding site. In this study we aimed the construction of a scFv upon hybridoma cells that produce an anti-LT monoclonal antibody following its bacterial production. A single-chain fragment variable with 723 bp was obtained and expressed as a protein with apparent molecular weight of 30 kDa in Escherichia coli strain. The scFvLT recombinant antibody was submitted to metal affinity chromatography and refolding and was tested by immunoenzimatic assays. Refolded scFvLT was able to recognized LT toxin by capture ELISA and Immunodot. However, scFvLT wasnt able to recognize LT toxin subunits by Immunoblotting neither neutralize its activity in Y1 adrenal cells.

Esta publicación busca presentar las metodologías utilizadas para la obtención de anticuerpos monoclonales, desde el cultivo celular de líneas llamadas hibridomas, mediante la criopreservación, la adaptación a distintos medios de cultivo, la amplificación celular, la cosecha de anticuerpos monoclonales y la criopreservación. Asimismo, este libro explica las técnicas empleadas para el proceso de purificación como son la evaluación del punto de producción de anticuerpos, la purificación de los anticuerpos empleando resinas y sistemas de cromatografia, la desalinización y la obtención de niveles de pureza aceptables. Se especifica que el objetivo central es emplear dichos anticuerpos en el desarrollo de futuros procedimientos de diagnóstico como ensayos de ELISA y desarrollo de prototipos de pruebas inmunocromatográficas. Los anticuerpos monoclonales desarrollados fueron dirigidos contra una proteína del virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar el cual es un patógeno que tiene un impacto sobre la producción avícola mundial. Esta investigación desarrolla los métodos empleados por la empresa FARVET en el marco de un proyecto de investigación cofinanciado por el Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA).