Orientador: Claudio Lucio Rossi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_Silmarade_M.pdf: 628754 bytes, checksum: 47779be4a8883bc3cd6f875ae5d3c17d (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A infecção causada pelo citomegalovírus humano (HCMV) é geralmente assintomática ou está associada a sintomas clínicos brandos e não específicos em pessoas imunocompetentes. Entretanto, o vírus pode causar doença grave em determinados tipos de pacientes, como crianças com infecção congênita e pessoas com comprometimento do sistema imune. O diagnóstico sorológico da infecção primária recente pelo HCMV é usualmente baseado na detecção de anticorpos específicos da classe IgM, soroconversão e/ou aumento significativo dos títulos de anticorpos específicos IgG. Como a soroconversão e a elevação significativa das concentrações de anticorpos dificilmente são observadas, a detecção de anticorpos IgM tem sido o marcador sorológico mais freqüentemente usado para o diagnóstico da infecção aguda. Entretanto, a baixa especificidade de muitos testes utilizados na pesquisa de IgM anti-HCMV e a persistência desses anticorpos em algumas pessoas durante vários meses, ou mesmo anos, têm gerado diagnósticos incorretos de infecção aguda, causando preocupações desnecessárias, especialmente em mulheres grávidas e em pacientes com comprometimento do sistema imune. Com base na observação que a avidez dos anticorpos aumenta gradualmente após a exposição a um imunógeno, vários trabalhos têm mostrado que a determinação da avidez dos anticorpos IgG pode ser utilizada para identificar infecções recentes e antigas, incluindo a infecção pelo HCMV. No Brasil, os testes comerciais para a determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-HCMV, além de muito caros, não estão disponíveis prontamente no mercado. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um teste de avidez imunoenzimático para o HCMV (ELISA HCMV), capaz de distinguir a infecção primária recente da infecção de longa duração. Na idealização do teste, foram considerados parâmetros importantes para laboratórios de rotina, como simplicidade e baixo custo. O teste foi padronizado com o kit comercial ETI-CYTOK G Plus (Sorin Biomedica, Itália), utilizando uréia 8 M para a dissociação dos anticorpos de baixa avidez. Para a validação do teste ELISA HCMV, a sua performance foi comparada com a do teste de avidez comercial automatizado VIDAS CMV IgG (bioMérieux, França), utilizando 24 soros de pacientes com infecção recente primária e 25 soros de pacientes com infecção de longa duração apresentando persistência de anticorpos específicos IgM. Resultados similares foram obtidos com os dois métodos de avidez. Todos os 24 soros de pacientes com infecção recentemente adquirida apresentaram índices de avidez compatíveis com infecção aguda utilizando o teste VIDAS CMV IgG, enquanto que um dos soros apresentou resultado duvidoso no teste ELISA HCMV. Os 25 soros de pacientes com infecção de longa duração apresentaram resultados idênticos com os dois métodos, com apenas um dos soros apresentando um valor não compatível. Estes resultados sugerem que o nosso teste de avidez pode ser potencialmente útil para o imunodiagnóstico da infecção pelo HCMV / Abstract: The infection caused by human cytomegalovirus (HCMV) is generally asymptomatic or is associated with mild non-specific clinical symptoms in immunocompetent subjects. The virus can, however, cause serious illness in congenitally infected infants and in immunocompromised patients. The serological diagnosis of a recently acquired HCMV infection is usually based on the detection of specific IgM antibodies, seroconversion, and/or a four-fold or greater rise in the titre of HCMV-specific IgG antibodies. Since seroconversion and a rise in IgG titres are seldom demonstrable, the detection of HCMV-specific IgM antibodies has been the most frequently used serological marker for diagnosing acute infection. However, the use of tests with a low specificity and the persistence, in some patients, of specific IgM antibodies for a long time have led to the misdiagnosis of acute HCMV infection and unnecessary concern, especially with respect to pregnant women and immunocompromised patients. Based on the observation that antibody avidity gradually increases after exposure to an immunogen, several reports have shown that the avidity of IgG antibodies can be used as a marker for identifying recent primary and long-term infections, including HCMV infections. In Brazil, commercial assays for evaluating the avidity of HCMV-specific IgG are expensive and are not readily available. The aim of this study was to standardize an economical and simple in-house HCMV-enzyme-linked immunosorbent assay avidity test (ELISA HCMV) for distinguishing recent primary from long-term infection. The test was standardized with the commercial kit ETI-CYTOK G Plus (Sorin Biomedica, Italy) using 8 M urea in phosphate-buffered saline to dissociate low-avidity antibodies. To validate the ELISA HCMV test, its performance was compared with that of the commercial automated VIDAS CMV IgG avidity assay (bioMérieux, France), using well-characterized sera from patients with recent primary and long-term HCMV infections. Forty-nine sera, 24 from patients with a recent primary HCMV infection and 25 from patients with a long-term HCMV infection with a sustained persistence of specific IgM antibodies, were tested. Similar results were obtained with the two avidity methods. All sera from the 24 patients with recently acquired infection had avidity indices compatible with acute HCMV infection by the VIDAS test, whereas with the in-house test, one serum sample had an equivocal result. In the 25 sera from patients with long-term infection, identical results were obtained with the two methods, with only one serum sample having an incompatible value. These findings suggest that our in-house avidity test could be a potentially useful tool for the immunodiagnosis of HCMV infection / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

O citomegalovírus (CMV), está entre os principais agentes infecciosos que acometem pacientes transplantados renais. A infecção por CMV está relacionada ao status sorológico do doador e receptor, bem como o tipo e intensidade da imunossupressão utilizada. A infecção, e em especial a doença citomegálica, determinam aumento da morbi-mortalidade após o transplante. O espectro da doença varia desde formas assintomáticas até a doença sistêmica grave com comprometimento de vários órgãos. A doença por CMV é diagnosticada através da evidência laboratorial de infeção, associada a quadro clínico compatível. A técnica da antigenemia identifica a presença do antígeno viral p65 em leucócitos do sangue periférico através de reação de imunoperoxidase utilizando-se anticorpos monoclonais. O objetivo principal deste trabalho foi o de determinar a incidência de infecção por CMV em uma coorte de pacientes transplantados renais usando a antigenemia como ferramenta diagnóstica. Secundariamente buscou-se avaliar o impacto desta infecção nas sobrevidas dos pacientes e dos enxertos em 6 anos de acompanhamento. No período de inclusão no estudo, janeiro de 1994 a fevereiro de 1995, foram realizados 74 transplantes renais na Santa Casa de Porto Alegre–RS. As amostras de sangue para a detecção da antigenemia foram obtidas semanalmente durante a internação hospitalar e posteriormente, sempre que houvesse suspeita clínica de infecção por citomegalovírus. Das 229 amostras analisadas, 51 (22,3%) foram positivas, em 24 pacientes, dos quais 41,6% (10/24) evoluíram de forma assintomática, 33,3% (8/24) apresentaram sintomas leves, e 25% (6/24) desenvolveram sintomas compatíveis com doença citomegálica. Desta forma, coorte estudada, a incidência de infecção e doença por CMV foram de 33,3% e 8,4%, respectivamente. Não houve associação entre as doses de imunossupressores, o uso de anticorpos monoclonais e número de episódios de rejeição com o desenvolvimento de infecção e doença por CMV. Nos transplantes realizados com doadores vivos, a incidência de infecção por CMV nos receptores de rins de doadores com sorologia positiva foi 61,9%, e nos receptores de doadores com sorologia negativa foi 14,3% (p=0,005). Os transplantes com receptores com sorologia negativa transplantados com rins de doadores soropositivos apresentaram incidência significativamente maior de infecção (75%) e doença (75%) por CMV do que os receptores com sorologia positiva transplantados com órgãos de doadores com soronegativos, 13,3% e 0%, respectivamente (p<0,05). A sensibilidade da antigenemia em detectar os pacientes que desenvolveram doença citomegálica foi de 100% e a especificidade foi 72,7%, com valor preditivo positivo de 25% e valor preditivo negativo de 100%. No grupo de pacientes que apresentou doença por CMV, ao término do seguimento, ocorreu um número significativamente mais elevado de perdas do enxerto (85%) do que no grupo de pacientes em que a infecção foi assintomática (29%), acarretando impacto negativo nas curvas de sobrevida de enxertos e pacientes (LogRank; p<0,05). A antigenemia mostrou ser uma ferramenta diagnóstica importante no manejo dos pacientes transplantados renais, possibilitando o diagnóstico precoce da infecção e auxiliando na identificação dos pacientes infectados que estão sob maior risco de desenvolvimento da doença. / Cytomegalovirus (CMV) is a major infectious agent in renal allograft recipients. CMV infection is related to the serologic status of the donor and the recipient, as well as to the type and dosage of immunossupression that the recipient is submitted to. Infection and specially disease due to CMV have determined a rise in morbidity and mortality after transplantation. The spectrum of the disease ranges from completely assymptomatic all the way up to a severe systemic disease with multiple organ compromise. CMV disease is diagnosed through laboratory evidence of infection associated with a compatible clinical presentation. Antigenemia technique identifies the presence of the p65 viral antigen in peripheral blood leukocytes through a peroxidase reaction, using monoclonal antibodies. The objective of this work was to determine the incidence of infection caused by CMV in a cohort of renal transplanted patients, using the antigenemia as a diagnostic tool. Furthermore, the outcome of graft and patients in a 6 year follow-up period was evaluated. During the period of inclusion in the study (January 1994 to February 1995), 74 renal transplants were performed at Santa Casa de Misericórdia, Porto Alegre, RS. Blood samples for detection of antigenemia were obtained weekly during the patient’s in-hospital period, and whenever there was a clinical suspicion of CMV infection afterwards. Of the 229 analyzed samples, 51 (22.3%) were positive in 24 patients, of which 41.6% (10/24) presented no symptoms, 33.3% (8/24) had mild symptoms, and 25% (6/24) developed symptoms compatible with CMV disease. In this cohort, the incidence of infection and CMV disease was 33.3% and 8.4%, respectively. There was no association between the dosage of immunosuppressive agents, the use of monoclonal antibodies and the number of rejection episodes with the development of infection or disease caused by CMV. In living related transplants, the incidence of CMV infection in receptors of serum positive donors was 61.9%, and in the recipients of serum negative donors it was 14.3% (p=0.005). Serum negative recipients transplanted with organs of serum positive donors presented a significantly greater incidence of infection (75%) and disease (75%) than the serum negative recipients transplanted with organs of serum negative donors, 13,3 % and 0% respectively (p<0.05). The sensibility of antigenemia to detect the patients that developed CMV disease was 100%, and the specificity was 72.7%, with a positive predictive value of 25% and a negative predictive value of 100%. At the end of the follow-up, in the group of patients who presented CMV disease the incidence of graft loss was significantly higher than the one observed in the group of patients who remained assymptomatic (85% versus 29% respectively), having a negative impact in the survival curve for both grafts and patients (LogRank; p<0.05). Antigenemia proved to be an important tool in the assessment of renal transplant patients, permitting the early diagnosis of disease, and the identification of infected patients that are at risk for the development of disease.

O citomegalovírus (CMV), está entre os principais agentes infecciosos que acometem pacientes transplantados renais. A infecção por CMV está relacionada ao status sorológico do doador e receptor, bem como o tipo e intensidade da imunossupressão utilizada. A infecção, e em especial a doença citomegálica, determinam aumento da morbi-mortalidade após o transplante. O espectro da doença varia desde formas assintomáticas até a doença sistêmica grave com comprometimento de vários órgãos. A doença por CMV é diagnosticada através da evidência laboratorial de infeção, associada a quadro clínico compatível. A técnica da antigenemia identifica a presença do antígeno viral p65 em leucócitos do sangue periférico através de reação de imunoperoxidase utilizando-se anticorpos monoclonais. O objetivo principal deste trabalho foi o de determinar a incidência de infecção por CMV em uma coorte de pacientes transplantados renais usando a antigenemia como ferramenta diagnóstica. Secundariamente buscou-se avaliar o impacto desta infecção nas sobrevidas dos pacientes e dos enxertos em 6 anos de acompanhamento. No período de inclusão no estudo, janeiro de 1994 a fevereiro de 1995, foram realizados 74 transplantes renais na Santa Casa de Porto Alegre–RS. As amostras de sangue para a detecção da antigenemia foram obtidas semanalmente durante a internação hospitalar e posteriormente, sempre que houvesse suspeita clínica de infecção por citomegalovírus. Das 229 amostras analisadas, 51 (22,3%) foram positivas, em 24 pacientes, dos quais 41,6% (10/24) evoluíram de forma assintomática, 33,3% (8/24) apresentaram sintomas leves, e 25% (6/24) desenvolveram sintomas compatíveis com doença citomegálica. Desta forma, coorte estudada, a incidência de infecção e doença por CMV foram de 33,3% e 8,4%, respectivamente. Não houve associação entre as doses de imunossupressores, o uso de anticorpos monoclonais e número de episódios de rejeição com o desenvolvimento de infecção e doença por CMV. Nos transplantes realizados com doadores vivos, a incidência de infecção por CMV nos receptores de rins de doadores com sorologia positiva foi 61,9%, e nos receptores de doadores com sorologia negativa foi 14,3% (p=0,005). Os transplantes com receptores com sorologia negativa transplantados com rins de doadores soropositivos apresentaram incidência significativamente maior de infecção (75%) e doença (75%) por CMV do que os receptores com sorologia positiva transplantados com órgãos de doadores com soronegativos, 13,3% e 0%, respectivamente (p<0,05). A sensibilidade da antigenemia em detectar os pacientes que desenvolveram doença citomegálica foi de 100% e a especificidade foi 72,7%, com valor preditivo positivo de 25% e valor preditivo negativo de 100%. No grupo de pacientes que apresentou doença por CMV, ao término do seguimento, ocorreu um número significativamente mais elevado de perdas do enxerto (85%) do que no grupo de pacientes em que a infecção foi assintomática (29%), acarretando impacto negativo nas curvas de sobrevida de enxertos e pacientes (LogRank; p<0,05). A antigenemia mostrou ser uma ferramenta diagnóstica importante no manejo dos pacientes transplantados renais, possibilitando o diagnóstico precoce da infecção e auxiliando na identificação dos pacientes infectados que estão sob maior risco de desenvolvimento da doença. / Cytomegalovirus (CMV) is a major infectious agent in renal allograft recipients. CMV infection is related to the serologic status of the donor and the recipient, as well as to the type and dosage of immunossupression that the recipient is submitted to. Infection and specially disease due to CMV have determined a rise in morbidity and mortality after transplantation. The spectrum of the disease ranges from completely assymptomatic all the way up to a severe systemic disease with multiple organ compromise. CMV disease is diagnosed through laboratory evidence of infection associated with a compatible clinical presentation. Antigenemia technique identifies the presence of the p65 viral antigen in peripheral blood leukocytes through a peroxidase reaction, using monoclonal antibodies. The objective of this work was to determine the incidence of infection caused by CMV in a cohort of renal transplanted patients, using the antigenemia as a diagnostic tool. Furthermore, the outcome of graft and patients in a 6 year follow-up period was evaluated. During the period of inclusion in the study (January 1994 to February 1995), 74 renal transplants were performed at Santa Casa de Misericórdia, Porto Alegre, RS. Blood samples for detection of antigenemia were obtained weekly during the patient’s in-hospital period, and whenever there was a clinical suspicion of CMV infection afterwards. Of the 229 analyzed samples, 51 (22.3%) were positive in 24 patients, of which 41.6% (10/24) presented no symptoms, 33.3% (8/24) had mild symptoms, and 25% (6/24) developed symptoms compatible with CMV disease. In this cohort, the incidence of infection and CMV disease was 33.3% and 8.4%, respectively. There was no association between the dosage of immunosuppressive agents, the use of monoclonal antibodies and the number of rejection episodes with the development of infection or disease caused by CMV. In living related transplants, the incidence of CMV infection in receptors of serum positive donors was 61.9%, and in the recipients of serum negative donors it was 14.3% (p=0.005). Serum negative recipients transplanted with organs of serum positive donors presented a significantly greater incidence of infection (75%) and disease (75%) than the serum negative recipients transplanted with organs of serum negative donors, 13,3 % and 0% respectively (p<0.05). The sensibility of antigenemia to detect the patients that developed CMV disease was 100%, and the specificity was 72.7%, with a positive predictive value of 25% and a negative predictive value of 100%. At the end of the follow-up, in the group of patients who presented CMV disease the incidence of graft loss was significantly higher than the one observed in the group of patients who remained assymptomatic (85% versus 29% respectively), having a negative impact in the survival curve for both grafts and patients (LogRank; p<0.05). Antigenemia proved to be an important tool in the assessment of renal transplant patients, permitting the early diagnosis of disease, and the identification of infected patients that are at risk for the development of disease.

O citomegalovírus (CMV), está entre os principais agentes infecciosos que acometem pacientes transplantados renais. A infecção por CMV está relacionada ao status sorológico do doador e receptor, bem como o tipo e intensidade da imunossupressão utilizada. A infecção, e em especial a doença citomegálica, determinam aumento da morbi-mortalidade após o transplante. O espectro da doença varia desde formas assintomáticas até a doença sistêmica grave com comprometimento de vários órgãos. A doença por CMV é diagnosticada através da evidência laboratorial de infeção, associada a quadro clínico compatível. A técnica da antigenemia identifica a presença do antígeno viral p65 em leucócitos do sangue periférico através de reação de imunoperoxidase utilizando-se anticorpos monoclonais. O objetivo principal deste trabalho foi o de determinar a incidência de infecção por CMV em uma coorte de pacientes transplantados renais usando a antigenemia como ferramenta diagnóstica. Secundariamente buscou-se avaliar o impacto desta infecção nas sobrevidas dos pacientes e dos enxertos em 6 anos de acompanhamento. No período de inclusão no estudo, janeiro de 1994 a fevereiro de 1995, foram realizados 74 transplantes renais na Santa Casa de Porto Alegre–RS. As amostras de sangue para a detecção da antigenemia foram obtidas semanalmente durante a internação hospitalar e posteriormente, sempre que houvesse suspeita clínica de infecção por citomegalovírus. Das 229 amostras analisadas, 51 (22,3%) foram positivas, em 24 pacientes, dos quais 41,6% (10/24) evoluíram de forma assintomática, 33,3% (8/24) apresentaram sintomas leves, e 25% (6/24) desenvolveram sintomas compatíveis com doença citomegálica. Desta forma, coorte estudada, a incidência de infecção e doença por CMV foram de 33,3% e 8,4%, respectivamente. Não houve associação entre as doses de imunossupressores, o uso de anticorpos monoclonais e número de episódios de rejeição com o desenvolvimento de infecção e doença por CMV. Nos transplantes realizados com doadores vivos, a incidência de infecção por CMV nos receptores de rins de doadores com sorologia positiva foi 61,9%, e nos receptores de doadores com sorologia negativa foi 14,3% (p=0,005). Os transplantes com receptores com sorologia negativa transplantados com rins de doadores soropositivos apresentaram incidência significativamente maior de infecção (75%) e doença (75%) por CMV do que os receptores com sorologia positiva transplantados com órgãos de doadores com soronegativos, 13,3% e 0%, respectivamente (p<0,05). A sensibilidade da antigenemia em detectar os pacientes que desenvolveram doença citomegálica foi de 100% e a especificidade foi 72,7%, com valor preditivo positivo de 25% e valor preditivo negativo de 100%. No grupo de pacientes que apresentou doença por CMV, ao término do seguimento, ocorreu um número significativamente mais elevado de perdas do enxerto (85%) do que no grupo de pacientes em que a infecção foi assintomática (29%), acarretando impacto negativo nas curvas de sobrevida de enxertos e pacientes (LogRank; p<0,05). A antigenemia mostrou ser uma ferramenta diagnóstica importante no manejo dos pacientes transplantados renais, possibilitando o diagnóstico precoce da infecção e auxiliando na identificação dos pacientes infectados que estão sob maior risco de desenvolvimento da doença. / Cytomegalovirus (CMV) is a major infectious agent in renal allograft recipients. CMV infection is related to the serologic status of the donor and the recipient, as well as to the type and dosage of immunossupression that the recipient is submitted to. Infection and specially disease due to CMV have determined a rise in morbidity and mortality after transplantation. The spectrum of the disease ranges from completely assymptomatic all the way up to a severe systemic disease with multiple organ compromise. CMV disease is diagnosed through laboratory evidence of infection associated with a compatible clinical presentation. Antigenemia technique identifies the presence of the p65 viral antigen in peripheral blood leukocytes through a peroxidase reaction, using monoclonal antibodies. The objective of this work was to determine the incidence of infection caused by CMV in a cohort of renal transplanted patients, using the antigenemia as a diagnostic tool. Furthermore, the outcome of graft and patients in a 6 year follow-up period was evaluated. During the period of inclusion in the study (January 1994 to February 1995), 74 renal transplants were performed at Santa Casa de Misericórdia, Porto Alegre, RS. Blood samples for detection of antigenemia were obtained weekly during the patient’s in-hospital period, and whenever there was a clinical suspicion of CMV infection afterwards. Of the 229 analyzed samples, 51 (22.3%) were positive in 24 patients, of which 41.6% (10/24) presented no symptoms, 33.3% (8/24) had mild symptoms, and 25% (6/24) developed symptoms compatible with CMV disease. In this cohort, the incidence of infection and CMV disease was 33.3% and 8.4%, respectively. There was no association between the dosage of immunosuppressive agents, the use of monoclonal antibodies and the number of rejection episodes with the development of infection or disease caused by CMV. In living related transplants, the incidence of CMV infection in receptors of serum positive donors was 61.9%, and in the recipients of serum negative donors it was 14.3% (p=0.005). Serum negative recipients transplanted with organs of serum positive donors presented a significantly greater incidence of infection (75%) and disease (75%) than the serum negative recipients transplanted with organs of serum negative donors, 13,3 % and 0% respectively (p<0.05). The sensibility of antigenemia to detect the patients that developed CMV disease was 100%, and the specificity was 72.7%, with a positive predictive value of 25% and a negative predictive value of 100%. At the end of the follow-up, in the group of patients who presented CMV disease the incidence of graft loss was significantly higher than the one observed in the group of patients who remained assymptomatic (85% versus 29% respectively), having a negative impact in the survival curve for both grafts and patients (LogRank; p<0.05). Antigenemia proved to be an important tool in the assessment of renal transplant patients, permitting the early diagnosis of disease, and the identification of infected patients that are at risk for the development of disease.

Orientador : Yong Kun Park / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-14T18:34:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_JoaoCarlosDias_M.pdf: 5016372 bytes, checksum: af920e6ebcf3027ffa745ac39b043f84 (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: De urna amostra de quatro abacaxis '(Ananas comosus (L.) merril) cv Pérola, foram extraldos, por homogenização da polpa, sem adição de água, 2 800 ml de suco. Ao mesmo foi adicionado (NH4}2 504 a uma concentração de 40% de saturação. Após um perIodo de 16 horas de repouso a 40C a amostra foi centrifugada e o precipitado descartado. Ao sobrenadante foi adicionado (NH~}2 504 até 80% de saturação. Após 2lhoras de repouso a 4 C o precipitado foi separado por centrif~ gaçao e em seguida dialisado contra H20 durante 48 horas a 40C e contra tampao fosfato 0,05 M pH 6,0 durante outras 48 horas a 4 C. Após fracionamento com sulfato de amônio a peroxidase foi purificada em colunas de Dietilaminoetil celulose (DEAE-celulose) e carboximetil celulose (CM-celulose) sucessivarnen te. Na cromatografia em DEAE-celulose foram obtidas 5 frações distintas, eluidas com gradiente de NaCl. Em seguida cada uma das cinco frações foi submetida a cromatografia em c~ luna de CM-celulose. Na cromatografia da primeira fração ob tida da coluna de DEAE-celulose (em coluna de 'eM-celulose) foram obtidas duas frações denominadas fração V e fração VI. Na crornatografia em coluna de CM-celulose de cada uma das outras quatro frações obtidas na cromatografia em coluna de DEAE-celulose, foi obtida uma só fração em cada caso, sendo denominadas frações I, II, III e IV. As 6 frações contendo atividade de peroxidase foram dialisadas e liofilizadas para os estudos posteriores. Para a determinação do pH ótimo de atividade das vã rias isoenzimas da peroxidase do abacaxi foram utilizados os tampões acetato e fosfato. As frações I, II e III apresenta ram um pH ótimo de 5,2; a fração IV apresentou um ótimo de atividade a pH 5,4 e as frações V e VI apresentaram pH ótimo de 5,0. O estudo da estabilidade térmica foi conduzido submetendo-se as diversas frações a tratamentos a 75°, 80°, 85° e 90 C por tempos de 30",1',2' e 3'; sendo logo a seguir d~ terminadas as atividades residuais. Utilizando-se a equação de Arrhenius determinaram-se as energias de inativação que foram da ordem de 23 a 37 kcal/mol para as várias frações / Abstract: From a sample of four pineapples . {Ananas comosus (L. ) merril) Perola breed, 2 800 ml of juice were extracted, by homogenization of the pulp, without water addition. Anm:>nÍUm sulfate at a concentration of 40% of saturation was added to the jui ce. After a period of resting, the sample was centrifugated and the precipitate was discarded. Enough (NH4)2 504 was ad ded to he supernatant in order to reach a concentration of 80% of saturation. A new resting period was followed by cen trifugation. The resulting supernatant was discarded, and the precipitate was dialised. The purification of the peroxidase started afterwards, with the use of the Ionic cromatography technique. First of alI the dialised was applied to a previously prepared Die thyl-aminoethylcellulose (DEAE-celulose) oolumn and eluted from it with the use of increasing concentrations of NaCI. Five distinct fractions were obtained in this phase. Only the first fraction was shown not to link i tself to DEAE~e'el lulose and was therefore called "the unlinked fraction". The four other anionic fractions were identified by the numbers I through IV. Each one of the five fractions was dialised and added to a previously prepared carboxymethylcellulose(CM celulose) column and eluted from it with increasing concen trations of Na CI. When submitted to CM-cellulose c hroma to graphy the unlinked fraction generated two other fractions, (V and VI) one of them classificated as no-ionic because it didn't linked itself to the CM-cellulose too, and the last one classificated as cationic because it linked itself to CM-cellulose. Fractions I through IV, when submitted to an identical process generated each one a single final fraction. The anionic character of fractions I through IV was shown by the fact that none of their final fractions linked itself to CM-eellulose. The six fraetions were dialised and liofilised for storage in order to allow later experiments. The optimum pH determination for eaeh one of the seve ral isoenzimes of pineapple peroxidase were made using sodium aeetate bUffer solutions for the aeidie pH and phosphate buffer solutions for the basie pH The following values we re obtained: 5,2 for three of the anionie isoenzimes; 5,4 for the other and 5,0 for the ~wo other ones. The study of the thermal stability of the was eondueted submitig the several fraetions to at 75°, 80°, 85° and 900C for periods of 30", 1', 2' and 3'; followed by imediate determination of the remainding peroxi dase aetivities. With the utilization of the Arrhenius equ~ tion, the inativation energies were determined and were to range from 23 to 37 keal/mol for the several fraetions / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-11T16:04:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_IdentificacaoFontesAlimentares.pdf: 390524 bytes, checksum: 30da67281c86b34fe1809bf589257afc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-04-10T14:24:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_IdentificacaoFontesAlimentares.pdf: 390524 bytes, checksum: 30da67281c86b34fe1809bf589257afc (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-10T14:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_IdentificacaoFontesAlimentares.pdf: 390524 bytes, checksum: 30da67281c86b34fe1809bf589257afc (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2006 / O ensaio imunoenzimático para identificação de repastos sangüíneos apresenta especificidade até nível de gênero, sensibilidade para identificação de repastos sangüíneos parciais e detecção de repastos múltiplos. Foram identificadas as fontes alimentares de 82% dos anofelinos coletados em campo. Foram testados seis anticorpos monoclonais (humano, suíno, cão, bovino, rato e galinha) e destes, apenas o anti- IgG bovino apresentou instabilidade. Obteve-se 55,7% (519/932) dos repastos positivos para sangue humano, o que demonstra, a preferência alimentar destes anofelinos por humanos. Dos 206 mosquitos que apresentaram repasto único, 27,6% foi em humanos. O Anopheles darlingi apresentou 41% dos repastos em humanos e o Índice de Sangue Humano (HBI) no intradomicílio foi de 0,71. An. marajoara apresentou 51,3% dos repastos em humanos, embora tenha sido encontrada em grande quantidade no ambiente extradomiciliar e apresentando HBI no intradomicílio de 0,76. O An. nuneztovari foi a espécie mais abundante, apresentando comportamento exofílico e antropofílico, com 53,8% de repastos em humano e HBI no intradomicílio de 0,65. O método ELISA Sanduíche está implantado, identificando a fonte alimentar das espécies de anofelinos coletadas em campo, exceto para bovino. É a primeira vez que esta técnica é utilizada para determinação de repastos sanguíneos em anofelinos na região Amazônica brasileira. É importante a determinação da fonte alimentar das espécies de anofelinos no sentido de caracterizar o comportamento antropofílico e assim associá-las ou não à transmissão de malária. / The immunoenzymatic assay for the bloodmeal identification has specificity till genus level, sensitivity for the identification of partial bloodmeal and detection of multi bloodmeal. It was detected the blood source of 82% of all mosquitoes specimens collected at the transmission area. We had testes six monoclonal antibodies for human, pig, dog, bovine, rat and chicken, and from them, only the bovine one had been unstable. It was obtained 55,7% (519/932) of the blood source for human, which demonstrated, these mosquitoes preference for human blood. From the 206 mosquitoes that had just a unique blood source, 27,6% were in human. The Anopheles darlingi had fed in human (41%) and his human bloodmeal index (HBI) indoor was 0,71. An. marajoara had presented 51,3% of the bloodmeal in humans, although had been collected in large amount outdoor and showed the HBI indoor of 0,76. The An. nuneztovari was the specie more abundant, demonstrating an exophilic and anthropophilic behavior, with 53,8% of blood source in humans and the HBI indoor of 0,65. The ELISA test is established, identifying the blood source of the anopheline mosquitoes collected in the malaria transmission area, except for bovine. This is the first time that this technique is being used for the determination of the blood source in anopheline mosquitoes in Brazilian Amazonia. It is very important the determination of the blood source of the anopheline species in order to characterize their anthropophilic behavior and to associate them or not with the malaria transmission.

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 47.pdf: 882272 bytes, checksum: 401f86c677016c9683a9566630f091be (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Produtos biológicos, tais como soros hiperimunes e vacinas, podem ser definidos como produtos derivados ou produzidos a partir de organismos vivos. Isso implica que suas características podem variar de um lote para outro. Conseqüentemente, um minucioso controle da qualidade na liberação de lotes é requerido para garantir que esses produtos sejam seguros e eficazes. O ensaio de potência com animais é um dos ensaios preconizados para garantir a qualidade das vacinas e soros hiperimunes. Somente para realização do ensaio de potência para o produto final de vacinas e soros antidiftéricos (SAD) e antitetânicos (SAT), são utilizados no INCQS cerca de 5.000 animais por ano, desses aproximadamente 4.500 animais são utilizados na etapa de soroneutralização e o restante na etapa de imunização. Neste contexto, e baseado nos princípios dos 3Rs, o objetivo deste trabalho foi padronizar e validar o método imunoenzimático de inibição da ligação da toxina (ToBI) capaz de avaliar a potência de SAD, SAT e de vacinas bacterianas combinadas: tétano-difteria uso adulto (dT) e uso infantil (DT) e tétano-difteria-pertussis (DTP), como alternativa da etapa de soroneutralização do ensaio de controle de potência. Os resultados encontrados indicam que o método proposto apresenta linearidade, especificidade e precisão (intra e inter-ensaio) satisfatórias e que é um ensaio confiável, rápido e conveniente para avaliar a potência de componentes diftérico e tetânico presentes em vacinas e soros hiperimunes. Além disso, reduz drasticamente o número de animais usados, o tempo na liberação de laudos e os custos associados ao controle da qualidade destes produtos. O método ToBI apresenta potencial para a substituição do ensaio em animais na determinação de potência de vacinas e soros antidiftéricos e antitetânicos... / Produtos biológicos, tais como soros hiperimunes e vacinas, podem ser definidos como produtos derivados ou produzidos a partir de organismos vivos. Isso implica que suas características podem variar de um lote para outro. Conseqüentemente, um minucioso controle da qualidade na liberação de lotes é requerido para garantir que esses produtos sejam seguros e eficazes. O ensaio de potência com animais é um dos ensaios preconizados para garantir a qualidade das vacinas e soros hiperimunes. Somente para realização do ensaio de potência para o produto final de vacinas e soros antidiftéricos (SAD) e antitetânicos (SAT), são utilizados no INCQS cerca de 5.000 animais por ano, desses aproximadamente 4.500 animais são utilizados na etapa de soroneutralização e o restante na etapa de imunização. Neste contexto, e baseado nos princípios dos 3Rs, o objetivo deste trabalho foi padronizar e validar o método imunoenzimático de inibição da ligação da toxina (ToBI) capaz de avaliar a potência de SAD, SAT e de vacinas bacterianas combinadas: tétano-difteria uso adulto (dT) e uso infantil (DT) e tétano-difteria-pertussis (DTP), como alternativa da etapa de soroneutralização do ensaio de controle de potência. Os resultados encontrados indicam que o método proposto apresenta linearidade, especificidade e precisão (intra e inter-ensaio) satisfatórias e que é um ensaio confiável, rápido e conveniente para avaliar a potência de componentes diftérico e tetânico presentes em vacinas e soros hiperimunes. Além disso, reduz drasticamente o número de animais usados, o tempo na liberação de laudos e os custos associados ao controle da qualidade destes produtos. O método ToBI apresenta potencial para a substituição do ensaio em animais na determinação de potência de vacinas e soros antidiftéricos e antitetânicos. Entretanto, para efeitos regulatórios, se faz necessária a realização de um estudo colaborativo, envolvendo laboratórios de diversos segmentos, para conclusão da validação da metodologia considerando os parâmetros já avaliados nessa etapa.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 liana_pereira_ioc_mest_2014.pdf: 4702231 bytes, checksum: 2246716c6d5dbccb2563a99addb4684d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A síndrome pulmonar por hantavírus (SPH) tem sido registrada no Brasil desde 1993 e a transmissão para o homem ocorre através da inalação de partículas virais presentes em aerossóis de excretas de roedores infectados. No Brasil, nove genótipos virais caracterizados a partir de roedores e/ou humanos foram descritos, sendo seis comprovadamente patogênicos. Desde os primeiros registros, mais de 1600 casos humanos foram confirmados, com ampla distribuição entre a maioria dos estados brasileiros e alta taxa de letalidade. A SPH apresenta-se como doença febril aguda caracterizada pelo grave comprometimento cardiovascular e respiratório. Os pacientes podem exibir uma ampla variedade de manifestações clínicas, onde os sinais e sintomas podem ser confundidos com os de outras doenças. Assim é necessário o diagnóstico diferencial separando casos de SPH de outros agravos com manifestações clínicas semelhantes, como é o caso da dengue. Embora não existam relatos de casos humanos no estado do Rio de Janeiro, foram encontradas evidências sorológicas em humanos e confirmação de circulação de hantavírus patogênico entre roedores silvestres, mais especificamente, na espécie Oligoryzomys nigripes, no Parque Nacional da Serra dos Órgãos, em Teresópolis Neste cenário, este estudo teve como objetivos avaliar a infecção por hantavírus em amostras humanas e em amostras de roedores silvestres e sinantrópicos provenientes de diversos municípios fluminenses. Um total de 497 amostras de soro de pacientes negativos para dengue pelos testes sorológicos, cedidas pelo LACEN/RJ, provenientes de 25 municípios, e de 235 amostras de roedores provenientes de sete municípios, foram analisadas através do ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos anti-hantavírus da classe IgM e IgG (ELISA IgM e IgG) e de testes moleculares. Cinco amostras de pacientes (1%) procedentes dos municípios de Valença, Vassouras e Nova Friburgo foram ELISA-IgM reativas. Um roedor (0,42%) da espécie Oligoryzomys nigripes ELISA-IgG foi reativo no município de Valença. A ausência de RNA nas amostras humanas impossibilitou a realização de testes moleculares para caracterização e identificação do vírus, porém na amostra do roedor reativo foi possível detectar a variante viral Juquitiba como responsável pela infecção deste espécime Em conclusão, a identificação do hantavírus patogênico Juquitiba em roedores silvestres e a evidência sorológica de infecção em amostras humanas neste estudo reforçam a importância e a necessidade de vigilância da SPH no estado do Rio de Janeiro / Toxoplasma gondii usually causes an asymptomatic infection, but it can present severity during pregnancy and in immunocompromised patients . Current therapies for toxoplasmosis are restricted only against tachyzoites, and have little or no effect on bradyzoites, which are kept in tissue cysts like source of the infection recrudescent. Consequently, new therapeutic alternatives have been proposed, as the use of Atovaquone that showed some effica cy against tachyzoites and bradyzoites in tissue cysts. In this work, we propose to study the effect of 3 - BrPA, a compound that is being tested against cancer cells, on the infection of LLC - MK 2 cells with tachyzoites of T. gondii (RH strain) . N o effect of 3 - BrPA on host cell proliferation and viability was observed. Evaluation of 3 - BrPA interference on in vitro growth of T. gondii showed a reduction in intracellular parasite proliferation about 55% after 24 h of treatment, and 61% after 48 h. Intracellular d evelopment of parasite, analyzed by SEM, showed morphological characteristics commonly found in tissue cysts. Incubation of cultures with DBA lectin confirmed the development of cysts and TEM showed the presence of bradyzoites. Moreover, we revealed the pr esence of degraded parasites and the influence of compound on endodyogeny. Another approach used was the treatment of infected cultures with combination of 3 - BrPA and Atovaquone. This r esulted in the reduction of intracellular parasites of 73% after 24 h o f treatment and 71% after 48 h, compared to control, besides the absence of cyst wall formation in these cultures. The refore, it is concluded that use of 3 - BrPA may pres ent as an important tool for study of: (i) in vitro c ystogenesis , (ii) the metabolism o f the parasite, requiring deeper understanding of the target of action of the compound in T. gondii , (iii) the alternatives metabolic pathways of the parasite, and (iv) the molecular / cellular triggered that led to death of the parasites mechanisms.

Introdução: A doença celíaca é uma condição autoimune que afeta cerca de 1% da população geral. Seu único tratamento é a dieta livre do glúten de trigo, centeio e cevada, que deve durar por toda vida. Objetivos: Esse estudo foi desenhado com o intuito de avaliar a presença de glúten por meio de teste imunocromatográfico e de R5-ELISA em alimentos comercializados no Brasil com o rótulo “sem glúten” e para determinar se o método imunocromatográfico é um método confiável e sensível o suficiente para detectar glúten em níveis “seguros” para celíacos. Materiais e métodos: Analisamos setenta amostras de alimentos embalados comercializados com o rótulo sem glúten, incluindo farinhas e biscoitos, entre outros. A extração do glúten foi feita por solução de etanol e após analisado por kit R5-ELISA e fitas imunocromatográficas disponíveis comercialmente. Resultados: Mais de um quarto das amostras analisadas (28,6) por R5-ELISA apresentaram teor de glúten acima de 5 ppm. Em quase metade dessas (12,9%) foi detectado nível de glúten superior a 20 ppm, o máximo tolerado pelo Codex Alimentarius para alimentos naturalmente livres de glúten. O método imunocromatográfico é qualitativo, fornecendo resultados positivos para amostras que tenham 5 ppm de glúten ou mais. 27,1% das amostras apresentaram resultado positivo quando testadas pelas fitas imunocromatográficas. Não encontramos diferença significativa entre os resultados do R5-ELISA iguais ou superiores a 5 ppm de glúten e os positivos para o teste imunocromatográfico (McNemar, p=1,00). Ao compararmos o R5-ELISA (> 5 ppm de glúten) com o método imunocromatográfico, encontramos uma sensibilidade de 90% e especificidade de 98%, (Kappa=0,89). Conclusões: Encontramos glúten em uma alta proporção das amostras utilizando os dois métodos. Nesse estudo também demonstramos que o teste imunocromatográfico bastante sensível para a detecção de glúten em níveis seguros aos portadores de doença celíaca e pode servir como uma alternativa barata e rápida ao R5-ELISA. / Objectives: This study was designed to compare the effectiveness of the R5-ELISA and immunochromatographic assays in detecting gluten in Brazilian foods labeled gluten-free and to determine if the immunochromatographic method is a sensitive and reliable method for detecting gluten at levels recommended as safe by the Codex Alimentarius Commission. Materials/Methods: We analyzed seventy different commercially available foods that were labeled “gluten-free” including several types of flours and snacks. Gluten was extracted by ethanol precipitation and subsequently analyzed using a commercially available immunochromatographic test and R5-ELISA kit. Results: More than a quarter of the samples (28.6%) analyzed by ELISA contained levels of gluten greater than 5 ppm. Almost half of these (12.9%) exhibited levels that exceeded 20 ppm, the maximum gluten level recommended by the Codex Alimentarius for a naturally gluten free product. The immunochromatographic method is qualitative and returns a positive reading for samples that contain gluten levels greater than 5 ppm. We found 27.1% of the samples tested positive in the immunochromatographic test. There was no statistically significant difference between the results of the ELISA (detection value >5 ppm) and the immunochromatographic test (McNemar test, p = 1.00). Comparing the ELISA (>5 ppm) and immunochromatographic test, we obtained 90% sensitivity and 98% specificity (Kappa of 0.89). Conclusions: We found gluten in a high proportion of the samples tested using both methods. In this study we also demonstrate that the immunochromatographic method is nearly as sensitive as the ELISA in detecting gluten levels and thus may serve as an inexpensive and rapid alternative to the R5-ELISA screening test.

Introdução: A doença celíaca é uma condição autoimune que afeta cerca de 1% da população geral. Seu único tratamento é a dieta livre do glúten de trigo, centeio e cevada, que deve durar por toda vida. Objetivos: Esse estudo foi desenhado com o intuito de avaliar a presença de glúten por meio de teste imunocromatográfico e de R5-ELISA em alimentos comercializados no Brasil com o rótulo “sem glúten” e para determinar se o método imunocromatográfico é um método confiável e sensível o suficiente para detectar glúten em níveis “seguros” para celíacos. Materiais e métodos: Analisamos setenta amostras de alimentos embalados comercializados com o rótulo sem glúten, incluindo farinhas e biscoitos, entre outros. A extração do glúten foi feita por solução de etanol e após analisado por kit R5-ELISA e fitas imunocromatográficas disponíveis comercialmente. Resultados: Mais de um quarto das amostras analisadas (28,6) por R5-ELISA apresentaram teor de glúten acima de 5 ppm. Em quase metade dessas (12,9%) foi detectado nível de glúten superior a 20 ppm, o máximo tolerado pelo Codex Alimentarius para alimentos naturalmente livres de glúten. O método imunocromatográfico é qualitativo, fornecendo resultados positivos para amostras que tenham 5 ppm de glúten ou mais. 27,1% das amostras apresentaram resultado positivo quando testadas pelas fitas imunocromatográficas. Não encontramos diferença significativa entre os resultados do R5-ELISA iguais ou superiores a 5 ppm de glúten e os positivos para o teste imunocromatográfico (McNemar, p=1,00). Ao compararmos o R5-ELISA (> 5 ppm de glúten) com o método imunocromatográfico, encontramos uma sensibilidade de 90% e especificidade de 98%, (Kappa=0,89). Conclusões: Encontramos glúten em uma alta proporção das amostras utilizando os dois métodos. Nesse estudo também demonstramos que o teste imunocromatográfico bastante sensível para a detecção de glúten em níveis seguros aos portadores de doença celíaca e pode servir como uma alternativa barata e rápida ao R5-ELISA. / Objectives: This study was designed to compare the effectiveness of the R5-ELISA and immunochromatographic assays in detecting gluten in Brazilian foods labeled gluten-free and to determine if the immunochromatographic method is a sensitive and reliable method for detecting gluten at levels recommended as safe by the Codex Alimentarius Commission. Materials/Methods: We analyzed seventy different commercially available foods that were labeled “gluten-free” including several types of flours and snacks. Gluten was extracted by ethanol precipitation and subsequently analyzed using a commercially available immunochromatographic test and R5-ELISA kit. Results: More than a quarter of the samples (28.6%) analyzed by ELISA contained levels of gluten greater than 5 ppm. Almost half of these (12.9%) exhibited levels that exceeded 20 ppm, the maximum gluten level recommended by the Codex Alimentarius for a naturally gluten free product. The immunochromatographic method is qualitative and returns a positive reading for samples that contain gluten levels greater than 5 ppm. We found 27.1% of the samples tested positive in the immunochromatographic test. There was no statistically significant difference between the results of the ELISA (detection value >5 ppm) and the immunochromatographic test (McNemar test, p = 1.00). Comparing the ELISA (>5 ppm) and immunochromatographic test, we obtained 90% sensitivity and 98% specificity (Kappa of 0.89). Conclusions: We found gluten in a high proportion of the samples tested using both methods. In this study we also demonstrate that the immunochromatographic method is nearly as sensitive as the ELISA in detecting gluten levels and thus may serve as an inexpensive and rapid alternative to the R5-ELISA screening test.