Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-11-18T17:30:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira (flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-11-19T14:44:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-19T14:44:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) Dissertação_ICS_ Aryane Cruz Oliveira Pinho.pdf: 1250285 bytes, checksum: fafeffcff293f340f84d3a6bb723e282 (MD5) / Pronex-Dengue; CNPq; FAPESB; CAPES / A Dengue é uma arbovirose que causa sérios problemas de saúde, em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Vírus Dengue (DENV), agente etiológico da doença, pertence ao gênero Flavivirus, cujas características antigênicas o classificam em quatro sorotipos: DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. Com o intuito de realizar a caracterização molecular do DENV circulante em Salvador-Bahia no período de maio/2011 à maio/2012, neste estudo foram analisadas 214 amostras de soros de pacientes com suspeita de infecção pelo DENV. O RNA viral foi extraído diretamente do soro dos pacientes para diagnostico molecular através de transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e posterior sorotipagem viral pela técnica de Nested-PCR. O DENV foi detectado em 93 amostras por RT-PCR e o Nested-PCR revelou a presença de três sorotipos circulantes em Salvador, sendo 13 amostras positivas para DENV 2, 3 amostras para DENV 3 e 77 para DENV 4, revelando assim a alta ocorrência de DENV4. Uma análise comparativa do teste imunocromatográfico rápido utilizado atualmente em centros de saúde para diagnóstico de infecções pelo DENV e o diagnóstico molecular do DENV revelou que o teste imunocromatográfico é mais eficaz na detecção em indivíduos infectados. Foi realizado isolamento do DENV4 a partir de soro, utilizando cultivo celular de Aedes albopictus clone C6/36 e a resposta imune contra proteínas E, prM, NS1 e NS3 do DENV4 foi demonstrada por Western Blot. O seqüenciamento e análise filogenética do gene E das sequências virais mostraram que elas pertencem ao genótipo I (cepas Asiáticas) de forte homologia com cepas isoladas no VietNam. Concluindo, esses resultados indicam a co-circulação de vários sorotipos com uma maior incidência do DENV4 e confirma a detecção de DENV4 genotipo I no Brasil a partir do Sudeste Asiático. Um diagnóstico imediato da infecção aliado a um diagnostico molecular dos sorotipos/genótipos circulantes na comunidade poderiam ser medidas de prevenção e controle para riscos potenciais de formas graves da doença numa população.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T12:41:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado - Gabriel Sylvestre Ribeiro.pdf: 1533452 bytes, checksum: 8d2db7800d46ef716ec2f56b355c2d8e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T12:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado - Gabriel Sylvestre Ribeiro.pdf: 1533452 bytes, checksum: 8d2db7800d46ef716ec2f56b355c2d8e (MD5) Previous issue date: 2012-03-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue é transmitido nas Américas por mosquitos Aedes aegypti. Este é adquirido através da picada em um hospedeiro em viremia e passa por intensa replicação em diferentes tecidos do inseto até tornar-se transmissível, após as partículas virais atingirem a luz das glândulas salivares. A partir deste momento o vírus pode ser inoculado, juntamente com a saliva, em todos os hospedeiros suscetíveis nos quais a fêmea se alimentar. Supõe-se que o vírus da dengue gere efeitos negativos sobre a biologia do mosquito, diminuindo o fitness dos indivíduos infectados. Apesar dos avanços recentes no conhecimento acerca de sua capacidade vetorial, ainda existem muitas lacunas na interação mosquito-vírus no par Ae. aegypti/dengue. Desta maneira, nosso objetivo é avaliar o impacto da infecção por DENV-2 no hábito alimentar do mosquito Ae. aegypti e, adicionalmente, monitorar a sobrevivência, longevidade, sucesso de oviposição e fecundidade de insetos infectados e controles. Duas populações foram testadas: Paea, confinada em laboratório desde 1994, e uma população de campo, coletada com o uso de ovitrampas em Tubiacanga (RJ). Fêmeas das duas populações foram aleatoriamente selecionadas para receber sangue infectado com 2x10-8 partículas de DENV-2 ou sangue com sobrenadante de cultura de célula livre de vírus, constituindo o grupo controle. Após a infecção oral, as fêmeas que estavam visualmente ingurgitadas foram confinadas individualmente em tubos de plástico. Ao longo de cinco semanas monitoramos aspectos de sua biologia e capacidade vetorial, tais como sua sobrevivência, fecundidade e cinco parâmetros do comportamento alimentar: tempo de início, o tempo gasto na localização do hospedeiro (camundongo anestesiado); o número de provas, quantas vezes a fêmea insere e retira sua probóscide do corpo do hospedeiro; tempo de prova, que termina quando notamos a inflação abdômen; o tempo de ingestão, que vai até a repleção total e retirada da probóscide do corpo do hospedeiro; tempo total de alimentação, a soma dos tempos de início, prova e ingestão. Utilizando uma análise de risco, fomos capazes de observar que a infecção pelo DENV-2 não modificou o hábito alimentar das fêmeas de Ae. aegypti. Por outro lado, a sobrevivência e a fecundidade foram menores quando a fêmea estava infectada com DENV-2. Através de uma ANOVA, observamos a influência da infecção na longevidade (F = 20,75 , gl = 1, P = 0,0001). A curva de sobrevivência das fêmeas infectadas apresentou queda significativamente mais intensa que a dos seus pares não-infectados (χ2 = 16,5, gl = 1, P < 0,001). Em relação à fecundidade, fêmeas infectadas têm menor sucesso de oviposição, ou seja, menor probabilidade de colocar ovos (χ2 = 14,40, gl = 3, p = 0,0024). Além disso, as fêmeas infectadas fazem a postura de um número significativamente menor de ovos do que seus pares não infectados. / Dengue virus is transmitted in the Americas by Aedes aegypti mosquitoes. This virus is acquired from an infected host through the bite and undergoes intense replication in different tissues of the insect becoming transmissible only after the viral particles reach the lumen of salivary glands. From this moment on the virus can be inoculated with saliva into all susceptible hosts the female will eat. It is assumed that the dengue virus generates negative effects on the mosquito’s biology, decreasing the fitness of infected individuals. Despite recent advances in knowledge of the Ae. aegypti vectorial capacity, there are still many gaps in the knowledge of the interaction between Ae. aegypti / dengue. Thus, our goal is to evaluate the impact of infection with DENV-2 in the feeding habits of the mosquito Ae. aegypti and additionally monitor the survival, longevity, oviposition success and fecundity of infected and control insects. Two populations were tested: Paea, confined in the laboratory since 1994, and one from the field, collected using ovitraps in Tubiacanga (RJ). Females of both populations were randomly selected to receive blood infected with 2x10-8 particules of DENV-2 or blood culture supernatant from virus-free cells, constituting the control group. After oral infection, the visually engorged females were separated individually in plastic tubes. We have monitored, over five weeks, aspects of their biology and vectorial capacity, such as survival, fecundity and five parameters of their feeding behavior: start time, the time spent in locating the host (anesthetized mice); the number of probes, how many times the female inserts and takes off her proboscis; probing time, that ends when we notice the abdomen inflation; ingestion time, that goes until the total repletion and proboscis withdrawal from the mouse’s body; total feeding time, the sum of start, probing and ingestion times. Using a failure-time analysis, we were able to observe that infection with DENV-2 did not change the feeding habits of Ae. aegypti. Moreover, the survival and fecundity were lower when the female was infected with DENV-2. Using an ANOVA, we observed the influence of infection on longevity (F = 20.75, df = 1, P = 0.0001). The survivorship of infected females showed a significantly more intense mortality than that of their non-infected counterparts (χ2 = 16.5, df = 1, P <0.001). Regarding fecundity, infected females had a low oviposition success, i.e., they were less likely to lay eggs (χ2 = 14.40, df = 3, p = 0.0024). Moreover, the postures of infected females had significantly lower numbers of eggs than the ones from their uninfected peers.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo788_1.pdf: 6555783 bytes, checksum: 65caeaca8f8ce8753df4239098b98438 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os vírus dengue (DENV) são responsáveis por um amplo espectro de manifestações clínicas em diversas partes do mundo. Muitos mecanismos moleculares da biologia do DENV, incluindo replicação do genoma e patogênese viral, ainda não foram totalmente compreendidos. Novos avanços na elucidação destes mecanismos vêm sendo facilitados pelo desenvolvimento dos sistemas de genética reversa nas últimas décadas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um sistema de genética reversa para o vírus dengue tipo 3 (DENV3). Usando um sistema de dois plasmídeos, o genoma do DENV3 foi dividido em duas partes por PCR e os fragmentos gerados foram clonados em separado num vetor plasmidial. Um sítio de restrição foi inserido em ambas as construções, permitindo a posterior recuperação do genoma completo por ligação in vitro. Todos os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e propagados nela para prevenir qualquer instabilidade dos insertos em E. coli. A identidade das construções foi confirmada por sequenciamento, no qual foram identificadas mutações no genoma clonado. Para a recuperação do clone infeccioso in vitro, as duas partes dos genomas foram amplificadas por PCR, digeridas e unidas por ligação in vitro. Dois clones infecciosos foram recuperados e a transcrição in vitro, do produto das ligações, produziram RNAs virais genômicos. Células BHK-21, transfectadas por eletroporação com os RNAs sintetizados, foram avaliadas por ensaio de imunofluorescência, mostrando que estes RNAs são infecciosos. Após sucessivas passagens em cultivo celular, os DENV3 recuperados foram caracterizados in vitro. RT-PCR, a partir de RNA viral, e a análise de fragmentos de restrição confirmaram que ambos os vírus recuperados foram derivados do nosso sistema de dois plasmídeos. No ensaio de placa, os clones apresentaram fenótipos distintos. Após coloração convencional, enquanto o clone ICDENV3 #L43 apresentou placas com morfologia similar ao DENV3 selvagem, o clone ICDENV3 #L42 foi incapaz de formar placas. A análise de sequenciamento, a partir dos produtos de RT-PCR, identificou mutações específicas em cada um dos clones, as quais podem facilitar o crescimento dos vírus recuperados em cultivo celular. Este sistema é uma poderosa ferramenta que nos ajudará a elucidar aspectos moleculares da biologia do DENV, bem como a entender a relação entre mutações específicas e a patogênese do DENV

O desenvolvimento de uma vacina para o controle da dengue é uma prioridade em todo o mundo. O domínio helicase da proteína NS3 (NS3H) viral alberga epítopos reconhecidos por linfócitos T citotóxicos, os quais tem papel importante na eliminação de células infectadas. Esse trabalho propôs a obtenção de uma forma recombinante, produzida em linhagens de Escherichia coli, da NS3H do DENV2 com características similares à proteína nativa e sua utilização como um potencial antígeno vacinal. A NS3H foi obtida na forma solúvel, foi reconhecida por anticorpos de camundongos e de humanos infectados e foi capaz de interagir com o RNA viral. Camundongos imunizados com NS3H coadministrada com diferentes adjuvantes desenvolveram respostas imunológicas específicas mas não foram protegidos após desafio. Em conjunto, os resultados indicam que a proteína NS3H recombinante preserva conformação e determinantes antigênicos da proteína viral nativa e pode ser útil em estudos sobre a biologia viral e na busca de estratégias anti-virais voltadas para o controle da dengue. / The development of a dengue vaccine is a worldwide priority. The helicase domain of viral NS3 protein (NS3H) preserves epitopes recognized by cytotoxic T lymphocytes, which plays an important role in the elimination of infected cells. This study aimed the generation of a recombinant NS3H form of a type 2 dengue virus (DENV2) lineage, in Escherichia coli strains, with properties similar to the native protein and its use as a potential vaccine antigen. The NS3H was obtained in soluble form, was recognized by antibodies from mice and human subjects and was able to interact with the viral RNA. Mice immunized with NS3H combined with different adjuvants developed specific immune responses but did not confer protection to a lethal challenge. Altogether, the results indicate that the recombinant NS3H protein preserves conformational and antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV biology and the search for anti-virus approaches.

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-06T12:53:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / CAPES / O vírus da dengue (DENV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, apresentando quatro sorotipos denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. No Brasil, a infecção pelo DENV-4 ressurgiu em 2010, após 31 anos, expondo a população ao alto risco de desenvolvimento da dengue grave, devido à co-circulação dos quatro sorotipos. Nesse contexto, os anticorpos monoclonais (AcM) apresentam-se como uma ferramenta importante devido à sua potencial aplicação como ferramenta biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi a produção e caracterização de AcM contra DENV-4. A metodologia para a produção de AcM foi desenvolvida por Köhler e Milstein (1975). Resumidamente, os animais de experimentação foram hiperimunizados com antígeno viral DENV-4, obtidos a partir da multiplicação do vírus em células de cultura C6/36, e subsequente concentração e precipitação com polietilenoglicol 8000. A triagem dos sobrenadantes dos hibridomas para reatividade ao DENV-4 foi realizada pelo Ensaio Imunoenzimático (ELISA), e a caracterização dos AcM foi realizada pelas técnicas de ELISA, Dot-Blot, Imunofluorescência Indireta (IFI), Western-Blot. Um total de dez hibridomas foram obtidos e os AcM produzidos foram denominados A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1, H12. Os AcM apresentaram diferentes perfis de reatividade frente aos diversos testes de detecção antigênica, demonstrando um reconhecimento direcionado principalmente para prM. Em conclusão, este estudo mostra o potencial de utilização dos AcM produzidos como insumo biotecnológico; sejam em estudos a respeito do vírus e sua patogênese, sejam em uma possível aplicação como ferramenta imunodiagnóstica. / Dengue virus (DV) is an arbovirus belonging to family Flaviviridae, genus Flavivirus, with four serotypes named DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. In Brazil, the infection by DENV-4 reemerged in 2010 after 31 years, exposing the population at high risk for developing severe diseases because of the co-circulation of the four serotypes. The monoclonal antibodies (AcM) are important tools due to its potential application in biotechnology. The aim of this work was to produce and to characterize of AcM against DENV-4. The methodology to produce AcM was developed by Köhler and Milstein (1975). Briefly, experimental animals were hyperimmunized with DENV-4 viral antigen obtained to virus multiplication in C6/36 culture cells and subsequent concentration and precipitation with polyethylene glycol 8000. ELISA test was performed to screen hybridoma supernatants for reactivity to DENV-4, and the characterization of AcM was performed by ELISA, Indirect Immunofluorescence (IFI), Dot-Blot and Western-Blot techniques. A total of ten hybridomas were obtained producing AcM named A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1 and H12. AcM showed different reactivity profiles in the tests, showing a dominant recognition to prM. In conclusion, this study shows the potential use of AcM produced as biotechnology tool; to study the virus and its pathogenesis, or a possible application in immunodiagnostic assays.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Dengue is currently considered the most important arbovirose. Its main vector is the mosquito Aedes aegypti, present in several regions around the world. The serological diagnosis by means of the NS1 antigen search is the one that has greater applicability, because of easy of execution and the window for detection between the 1st and the 9th day of the onset of symptoms, with a higher frequency until the 5th day. This study aimed to investigate the presence of dengue virus in samples with non-reactive results for the NS1 antigen, assessing if there was a failure in laboratorial diagnosis, or the existence of other arboviruses circulating in the state of Amazonas. Using the RT-qPCR technique, the presence of dengue virus was investigated in 306 serum samples from patients with clinical suspicion of infection. The samples that remained negative were investigated for the presence of the Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Oropouche (OROV) viruses with the same methodology, as well as the presence of IgG and IgM for dengue virus by ELISA. Of the 306 analyzed samples, 17 (5.5%) were positive for DENV, with three sequenced for serotype 4. Thirty-four (10.8%) were positive for ZIKV, one (0.3%) for CHIKV, thirteen 4.2%) for MAYV and nine (2.9%) for OROV. In relation to the NS1 test, all kits evaluated presented 100% agreement in negativity. For the screening of anti-DENV antibodies of the IgG class, of the 306 samples tested 134 (43.8%) had positive results. Regarding the detection of the IgM antibody, different positivities were observed for commercial kits: VIRION (n = 250) 35.6% positive; FOCUS (n = 105) 10.5% positive and PANBIO (N = 80) 20% positive. Our results confirm cases of false negative results for the NS1 tests of three commercial kits, in addition to the circulation of other arboviruses among patients from different municipalities in the state of Amazonas. / A dengue é considerada atualmente a mais importante arbovirose. O seu principal vetor é o mosquito da espécie Aedes aegypti, presente em diversas regiões do mundo. O diagnóstico sorológico por meio da pesquisa do antígeno NS1 é o que tem maior aplicabilidade, pela baixa complexidade na execução e por ser detectado entre o 1º e 9º dia de início dos sintomas, porém com frequência maior até o 5º dia. Esse estudo teve por objetivo principal investigar a presença do vírus dengue em amostras com resultados “Não Reagentes” para o antígeno NS1, avaliando se houve falha no diagnóstico laboratorial, ou a existência de outros arbovírus circulando no estado do Amazonas. Utilizando a técnica de RT-qPCR, pesquisou-se a presença do vírus dengue em 306 amostras de soros de pacientes com suspeita clínica de infecção. As amostras que continuaram negativas foram pesquisadas quanto a presença dos vírus Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) e Oropouche (OROV), pela mesma metodologia, bem como foi pesquisada a presença de anticorpos das classes IgG e IgM para o vírus dengue por ELISA. Das 306 amostras analisadas 17 (5,5%) foram positivas para DENV, com três sequenciadas para o sorotipo 4. Trinta e quatro (10,8%) foram positivas para o ZIKV, uma (0,3%) para CHIKV, treze (4,2%) para MAYV e nove (2,9%) para OROV. Em relação ao teste NS1 todos os kits avaliados apresentaram 100% de concordância em negatividade. Para a pesquisa de anticorpos anti-dengue da classe IgG, das 306 amostras testadas 134 (43,8%) tiveram resultados positivos. Em relação à detecção do anticorpo IgM foram observadas diferentes positividades para os kits comerciais: VIRION (n=250) 35,6% positivas; FOCUS (n=105) 10,5% positivas e PANBIO (N=80) 20% positivas. Nossos resultados confirmam casos de resultados falso-negativos, para os testes NS1 de três kits comerciais, além da circulação de outros arbovírus entre os pacientes de diferentes municípios do estado do Amazonas.

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.

O desenvolvimento de uma vacina para o controle da dengue é uma prioridade em todo o mundo. O domínio helicase da proteína NS3 (NS3H) viral alberga epítopos reconhecidos por linfócitos T citotóxicos, os quais tem papel importante na eliminação de células infectadas. Esse trabalho propôs a obtenção de uma forma recombinante, produzida em linhagens de Escherichia coli, da NS3H do DENV2 com características similares à proteína nativa e sua utilização como um potencial antígeno vacinal. A NS3H foi obtida na forma solúvel, foi reconhecida por anticorpos de camundongos e de humanos infectados e foi capaz de interagir com o RNA viral. Camundongos imunizados com NS3H coadministrada com diferentes adjuvantes desenvolveram respostas imunológicas específicas mas não foram protegidos após desafio. Em conjunto, os resultados indicam que a proteína NS3H recombinante preserva conformação e determinantes antigênicos da proteína viral nativa e pode ser útil em estudos sobre a biologia viral e na busca de estratégias anti-virais voltadas para o controle da dengue. / The development of a dengue vaccine is a worldwide priority. The helicase domain of viral NS3 protein (NS3H) preserves epitopes recognized by cytotoxic T lymphocytes, which plays an important role in the elimination of infected cells. This study aimed the generation of a recombinant NS3H form of a type 2 dengue virus (DENV2) lineage, in Escherichia coli strains, with properties similar to the native protein and its use as a potential vaccine antigen. The NS3H was obtained in soluble form, was recognized by antibodies from mice and human subjects and was able to interact with the viral RNA. Mice immunized with NS3H combined with different adjuvants developed specific immune responses but did not confer protection to a lethal challenge. Altogether, the results indicate that the recombinant NS3H protein preserves conformational and antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV biology and the search for anti-virus approaches.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese valeria.pdf: 2053227 bytes, checksum: 9897e5628e288900b234c5acbe0fb42b (MD5) Previous issue date: 2008-08-06 / Nowadays, dengue constitute the major public health problem, because is relevant cause of illness and death between thousands people that resident in the tropical and subtropical regions in world. The dengue virus is classified as four serotypes (DENV-1, 2, 3 and 4) according to antigenic differences and characterized intra-typical groups called genotypes. The laboratorial surveillance enables the diagnostic confirmation of dengue infection and monitoring serotypes circulating through the routine diagnostic techniques. Recently, the use molecular techniques has contributed to characterize and monitoring of the genotypes potentially virulent during epidemic and knowledge of biology of dengue virus. This thesis was organized in an introduction section, that include a literature review on dengue, and two manuscripts that describing the research conducted with focus on laboratory diagnostic and molecular epidemiology. The first manuscript entitled Laboratorial Surveillance of Dengue Virus in Central-Brazil, 1994-2003, was published at Journal of Clinical Virology, 2006 37 (3): 179-83. In this study we present the results of the virological surveillance for dengue cases conducted in the city of Goiânia (~1,200,000 population) from 1994 to 2003. Suspected cases were from the main public infectious disease reference hospital and outpatient clinics covering the metropolitan area. Serological and virus isolation tests were conduced at the regional reference laboratory. Our objective was to report dengue circulating serotypes from 1994 to 2003 and the role of distinct serotypes on dengue clinical outcomes in Central Brazil and to characterize serotypes and genotypes by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and by restricted site-specific PCR (RSS-PCR) patterns in selected samples. Laboratory surveillance identified mainly DEN-1 serotype from 1994 to 2002 shifting to a high circulation of DEN-3 in 2003. The adults (87,4%) were the most affected group and dengue fever accounted for the majority of the cases. Diagnosis of dengue was confirmed in ~50% of the suspected and enhanced by RT-PCR. RSS-PCR patterns for DEN-1 and DEN-3 corresponded to the circulating subtypes in the country. The infection DENV-3 did not suggest a major role of infecting DEN-3 in increasing disease severity during its first-year spread in Central Brazil. The second manuscript, to be submitted for publication is entitled: Epidemiologia Molecular do Vírus Dengue tipo 3 em Goiânia GO, 2005-2006. The objective of this manuscript was to characterize the DENV-3 genotype circulating isolated from well-characterized clinical and laboratory samples in Goiânia-GO/Brasil. Seven samples had sequences of the prM/M/E region obtained and comparative analysis was performed with the reference strains. The results showed the homology of the genomics sequences with genotype III strains. The nucleotide identity of the all the samples varied from 97.0% to 99.6% and the amino acid sequences from 97.5% to 99.5%. The analysis of the nucleotide sequence revealed silent mutation and 14 amino acid changes in the protein deduced from gene prM/M/E. In conclusion, the study confirms that the strains of DENV-3 in Central Brazil relate to genotype III. The genomic changes along Domain III of the protein E were observed, which could affect the pathogenicity, but were not consistent between samples of DCC and DHF. Samples of patients with dengue fever had mutations related to viral attenuation. More investigation is necessary to evidence of genomic changes found in relationship with clinical forms. / Atualmente, a dengue representa um dos maiores problemas em saúde pública, pois é causa de doença e morte entre milhares de pessoas que residem nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Os vírus dengue existem como quatro sorotipos virais (DENV-1 a DENV-4) de acordo com diferenças antigênicas, sendo caracterizados grupos intra-típicos denominados genótipos. A vigilância laboratorial possibilita a confirmação diagnóstica de infecção por dengue e o monitoramento de sorotipos circulantes, através de técnicas diagnósticas de rotina. Recentemente, o uso de técnicas moleculares tem contribuído para a caracterização e monitoramento de genótipos potencialmente virulentos na vigência de epidemias e melhor entendimento da biologia do vírus. Esta tese de doutorado compreende uma introdução que contempla uma revisão da literatura sobre dengue e dois manuscritos que descrevem as pesquisas realizadas com enfoque no diagnóstico laboratorial e epidemiologia molecular. O primeiro manuscrito intitulado Laboratorial Surveillance of Dengue Virus in Central-Brazil, 1994-2003, foi publicado no Journal of Clinical Virology, 2006 37 (3): 179-83. Neste estudo, apresentamos os resultados de uma vigilância laboratorial conduzida na cidade de Goiânia na região Centro-Oeste do Brasil, desde a introdução dos vírus dengue em 1994 até 2003. Casos com suspeita clínica de dengue foram atendidos em unidades de saúde e hospitais de referência da região metropolitana e os testes sorológicos e/ou isolamento viral realizados no laboratório de referência estadual LACEN-GO. Nosso objetivo foi descrever sobre os sorotipos virais circulantes de dengue nos anos de 1994 a 2003 e o seu papel nos desfechos clínicos de dengue na região Centro-Oeste do Brasil e caracterizar sorotipos e genótipos ou subtipos genômicos pela RT-PCR e RSS-PCR em amostras selecionadas. O sorotipo DENV-1 foi identificado como prevalente nos anos 1994 a 2002, sendo substituído por DENV-3 em 2003. Os adultos (87,4%) foram mais atingidos e a dengue clássica a mais diagnosticada. A dengue foi confirmada em 50% dos casos suspeitos de dengue incrementado pela RT-PCR. Os genótipos ou subtipos genômicos do DENV-1 e DENV-3 corresponderam circulantes no país. A infecção pelo DENV-3 não sugere um papel relevante no aumento da gravidade da doença durante seu primeiro ano de dispersão no Centro-Oeste do Brasil. O segundo manuscrito, a ser submetido à publicação, foi intitulado Epidemiologia Molecular do Vírus Dengue tipo 3 em Goiânia GO, 2005-2006. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o genótipo circulante do DENV-3 isolado de amostras bem caracterizadas clínica e laboratorialmente em Goiânia-GO/Brasil e analisar as alterações genômicas encontradas. Sete seqüências regiões prM/M/E, foram obtidas e analisadas em comparação com cepas protótipo do DENV-3. As seqüências do estudo apresentaram maior homologia com a cepas do genótipo III. O percentual de identidade nucleotídica das amostras do DENV-3 seqüenciadas variou de 97,0% a 99,6% e de aminoácidos 97,5% a 99,5%, mostrando-se conservadas. A análise da seqüência nucleotídica das amostras do estudo revelou mutações silenciosas e 14 substituições de aminoácidos na seqüência da proteína deduzida do gene prM/M/E. Em conclusão, o estudo confirma que as cepas de DENV-3 da região centrooeste pertencem ao genótipo III. Alterações genômicas significativas foram observadas ao longo do domínio III da proteína E, as quais poderiam afetar a patogenicidade, entretanto não foram consistentes entre as amostras de DCC e FHD. As amostras de pacientes com dengue clássica apresentaram alterações em resíduos de aminoácidos no domínio III relatados como pontos de atenuação viral. Maiores investigações serão necessárias para confirmar as alterações encontradas e sua relação com as formas clínicas.