Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A região C-terminal da proteína 1 de superfície de merozoítas de Plasmodium (MSP119) vem sendo estudada como um dos principais alvos para desenvolvimento de uma vacina contra malária. Estudos têm demonstrado a imunogenicidade desta região em vacinações experimentais utilizando proteínas recombinantes na presença de adjuvantes fortes. No presente estudo, consideramos a possibilidade da utilização de proteínas recombinantes baseadas na sequência da MSP119 para imunização de camundongos por uma via de mucosa. Também geramos novas proteínas recombinantes de fusão da MSP119 com a flagelina (proteína do flagelo de Salmonella enterica Typhimurium), com o intuito de aumentar a imunogenicidade deste antígeno. Avaliamos inicialmente a capacidade de atuação das moléculas toxina colérica (CT), toxina termo-lábil de E. coli (LT) e do oligodeoxinucleotídeo CpG ODN 1826 como adjuvantes em imunizações de camundongos pela via de mucosa intranasal, utilizando como antígenos as proteínas recombinantes baseadas na MSP119 de P. vivax His6PvMSP119 ou His6PvMSP119-PADRE (contendo o epítopo “helper” universal PADRE). Quando administradas na presença dos adjuvantes CT ou LT, ambas foram altamente imunogênicas pela via intranasal, induzindo altos títulos de anticorpos, maiores do que quando utilizamos o CpG ODN 1826 como adjuvante. A adição do CpG ODN 1826 em imunizações na presença de CT foi capaz de aumentar a resposta específica de IgG2c. Nossos resultados demonstraram que CT e LT são adjuvantes potentes de mucosa em imunizações com antígenos recombinantes de malária, e que o CpG ODN 1826 pode ser utilizado como ferramenta de modulação da resposta imune nestas imunizações. Subsequentemente, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da PvMSP119-PADRE fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PvMSP119-PADRE). Demonstramos que essa proteína de fusão retém as propriedades antigênicas da PvMSP119 e a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos utilizando somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células específicas produtoras de IFN-g medidas no baço dos animais imunes. A adição de CpG ODN 1826 nas imunizações foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c. Além disso, os soros dos camundongos imunizados foram capazes de reconhecer os parasitas por imunofluorescência indireta (IFA). Estes resultados demonstraram uma nova classe de antígenos candidatos à vacina contra malária, com atividade adjuvante intrínseca e capaz de estimular respostas imunológicas humoral e celular específicas, quando administrada sozinha ou na presença de outros adjuvantes. Por fim, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da MSP119 de P. falciparum (PfMSP119) fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PfMSP119). Demonstramos que esta proteína de fusão retém a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos com somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células produtoras de IFN-g específicas contra a PfMSP119. A adição de adjuvantes como CpG ODN 1826 ou Quil-A (saponina de Quillaja saponaria) nas imunizações com a proteína recombinante de fusão foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c, bem como de potencializar a resposta celular medida pela produção de IFN-g contra a PfMSP119. Os soros de coelhos imunizados com a His6FliC-PfMSP119 sem a adição de nenhum adjuvante apresentaram altos títulos de anticorpos específicos contra a PfMSP119, que foram capazes de inibir o crescimento do parasita in vitro. Esses resultados sugerem a estratégia de fusão de antígenos de plasmódios como uma alternativa viável de desenvolvimento de uma vacina barata e eficaz contra a malária. / The C-terminal region of Plasmodium merozoite surface protein 1 (MSP119) is being studied as one of the main targets for the development of a vaccine against malaria. Several studies have shown high imunogenicity of this region in experimental immunizations when injected in the presence of strong adjuvant formulations. In the present study we evaluate the possibility of using recombinant proteins based on the sequence of MSP119 to immunize mice by a mucosal route. Also, we generate new recombinant proteins consisting in the genetic fusion of the MSP119 to the flagellin FliC (flagellar protein of Salmonella enterica Typhimurium), to increase the immunogenicity of the antigen. Initially, we evaluated the capacity of the molecules cholera toxin (CT), heat-labile E. coli enterotixin (LT) or CpG ODN 1826, to act as adjuvants in mucosal intranasal immunization of mice with the recombinant proteins His6PvMSP119 or His6PvMSP119-PADRE (containing the universal T helper epitope PADRE). When administered in the presence of CT or LT, both recombinant proteins were highly immunogenic by the intranasal route. CpG ODN 1826 was less efficient as adjuvant by this route. The addition of CpG ODN 1826 in CT adjuvanted immunizations increased the specific IgG2c titers. These results showed that CT and LT are potent mucosal adjuvants in immunizations with recombinant malaria antigens and that CpG ODN 1826 can, in this case, be used as a tool to modulate the pattern of the immune response. Subsequently, we expressed a recombinant protein consisting of the sequence of PvMSP119-PADRE genetically fused to FliC (His6FliC-PvMSP119- PADRE). We showed that this fusion protein preserved the antigenic properties of PvMSP119 and the ability of flagellin to activate TLR5. The immunization of mice using this recombinant fusion protein induced high titers of specific antibodies and the presence of antigen-specific IFN-g producing cells in the spleen. The addition of CpG ODN 1826 in the vaccine formulations modulated the immune response by augmenting the specific titers of IgG2c. In addition, sera from immunized mice recognized the parasite in indirect immunofluorescence assay (IFA). Our results provided a new class of malaria vaccine formulation with intrinsic adjuvant property capable of stimulating specific humoral and cellular immune responses when administered alone or in the presence of other adjuvants. Finally, we expressed a recombinant protein containing the sequence of Plamodium falciparum MSP119 (PfMSP119) fused to FliC (His6FliC-PfMSP119). This fusion protein retained the capacity of flagellin to activate TLR5. Immunization of mice with the His6FliC-PfMSP119 alone induced high titers of specific antibodies and IFN-g producing cells. The addition of adjuvants such as CpG ODN 1826 or Quil-A (saponin of Quillaja saponaria) increased the levels of IgG2c and the cellular immune response, measured by the IFN-g secretion by immune spleen cells in culture. In addition, sera from immunized rabbits recognized the parasites in IFA and inhibited parasite growth in vitro. These results provide evidences that the fusion of malaria antigens to flagellin is an inexpensive and viable alternative for the development of a malaria vaccine. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T21:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 203662.pdf: 475109 bytes, checksum: e464cd29864fb9539659fc45b145953d (MD5) / A inflamação é uma resposta do organismo a um estímulo agressor, químico, físico ou biológico, que tem como finalidade restaurar a integridade tecidual. Este fenômeno biológico é realizado através do acúmulo e ativação de leucócitos no local da injúria, que contribuem para a eliminação de antígenos e recuperação da homeostase. A inflamação é, também, fundamental para o estabelecimento da imunidade específica e eficiência da imunização. Uma das medidas de imunização mais eficaz é a vacinação. Uma vacina deve ter alto poder imunogênico para ser eficaz na profilaxia de doenças infecto-contagiosas. Desta forma, elas são geralmente associadas a substâncias adjuvantes, que amplificam a resposta protetora da vacina. Entretanto, alguns destes adjuvantes induzem efeitos indesejáveis, tais como excesso de inflamação local e sinais flogísticos sistêmicos. O presente estudo pretendeu verificar a atividade inflamatória induzida por seis adjuvantes, associados a uma vacina contra vírus rábico para futuro uso em animais. Os adjuvantes testados neste trabalho foram o Algamulin, Avridine, Hidróxido de Alumínio, b-Glucana (2 e 4 mg), SEPPIC-I e SEPPIC-II. Para este objetivo as diferentes formulações adjuvantes (50µl) adicionadas à vacina (50µl), a vacina pura (50µl) e PBS (Controle) foram inoculados em uma bolha de ar (3ml) formada do dorso (subcutâneo) de camundongos albinos da linhagem Swiss. Após 24 e 72 horas do desafio, os animais foram sacrificados e o conteúdo celular obtido da cavidade foi associado à intensidade do processo inflamatório. A contagem total de células leucocitárias e suas subpopulações foi realizada por Citometria de Fluxo. Para a análise de subpopulações, os leucócitos foram preparados e marcados, conforme o protocolo da PharMingen®, com anticorpos conjugados com fluoresceína ou ficoeritrina-R, específicos para as populações de Linfócitos B (anti-CD 19), Linfócitos T (anti-CD 3) e sub-população de Linfócitos T (anti-CD 4 e anti-CD 8). Nossos resultados permitem concluir que: 1. Todos os adjuvantes induzem inflamação cutânea; 2. Existe diferença de intensidade e na qualidade do infiltrado inflamatório induzido entre os diferentes adjuvantes utilizados. Alguns adjuvantes induzem um infiltrado inflamatório predominantemente de células mononucleares, Outros de polimorfonucleares; 3. Estas diferenças parecem resultar em padrões de resposta imune diferentes, de acordo com a célula mais estimulada. Os padrões de resposta predominantemente mononuclear foram observados com SEPPIC-I e SEPPIC-II. O Padrão de resposta apresentando grande quantidade de células polimorfonucleares foi observado com Hidróxido de Alumínio, Algamulin e Beta Glucana; 4. Avridine apresentou um infiltrado misto no qual havia a presença tanto de células mononucleares quanto polimorfonucleares;

O pterígio é uma degeneração benigna da conjuntiva, que se estende em direção à córnea e acomete principalmente adultos habitantes de regiões intertropicais. A prevalência mundial varia de 0,7 a 31%. A patogênese exata permanece incerta, mas evidências atuais sugerem a participação de fatores genéticos e ambientais, principalmente a exposição crônica à radiação ultravioleta. O tratamento pode ser clínico, com uso de colírios para melhora dos sintomas, ou cirúrgico. Até os anos de 1980, a técnica de ressecção do pterígio com manutenção de área de esclera nua era predominante, porém apresentava taxas muito elevadas de recidiva. Desde então, tem-se procurado técnicas adjuvantes a essa para obtenção de melhores resultados e redução do número de recorrência. O presente estudo busca, por meio de comparações diretas e indiretas da network metanálise, identificar qual, dentre as várias técnicas utilizadas, seria a melhor a ser empregada. Após pesquisa em bases de dados foram selecionados 24 ensaios clínicos randomizados, computando 1815 olhos em 1668 pacientes, sendo possível comparar os seguintes tratamentos adjuvantes à técnica de esclera nua: associação de 5-Fluorouracil (5-FU), Betaterapia, Mitomicina C (MMC) em diferentes concentrações e Ciclosporina, além de transplante de membrana amniótica (TMA) e enxerto conjuntival, também associado ao uso de Bevacizumab, MMC e Ciclosporina. Foi possível realizar comparações diretas entre os seguintes tipos de intervenções: esclera nua versus esclera nua + Ciclosporina gotas 0,05%, enxerto conjuntival versus esclera nua + MMC 0,02% intraoperatória, enxerto conjuntival versus transplante de membrana amniótica, esclera nua versus esclera nua + MMC 0,02% intraoperatória e esclera nua versus enxerto conjuntival, sendo considerados os melhores, respectivamente: esclera nua + Ciclosporina gotas 0,05%, enxerto conjuntival, enxerto conjuntival, esclera nua + MMC 0,02% e enxerto conjuntival. Em relação à network metanálise, o ranqueamento ordenado do melhor para o pior procedimento na redução de recidiva foi o seguinte: enxerto conjuntival + Ciclosporina gotas 0,05%, esclera nua associada à MMC < 0,02%, esclera nua + Betaterapia (dose única de 2500 cGy), enxerto conjuntival + Betaterapia (dose única de 1000 cGy), esclera nua + MMC gotas 0,02%, enxerto conjuntival, esclera nua + MMC > 0,02%, esclera nua + Ciclosporina gotas 0,05%, esclera nua + 5FU intraoperatório 5%, transplante de membrana amniótica, esclera nua + MMC 0,02%, enxerto conjuntival + Bevacizumab gotas 0,05%, esclera nua + Bevacizumab e esclera nua. Em conclusão, diante das inúmeras possibilidades de combinações de tratamento para o pterígio, foi possível se estabelecer, a partir das técnicas comparadas em estudos clínicos publicados e disponibilidade dos recursos em cada serviço, o tratamento com menor recidiva. / Pterygium is a benign conjunctival degeneration towards the cornea which affects mostly adults who live in the intertropical regions. World prevalence is between 0,7 and 31%. The exact pathogenesis remains unclear but it´s known that genetics and environmental factors may predispose to this condition, specially cronic exposure to ultraviolet radiation which can cause oxidative stress and increase growth factors production. Treatment can be simptomatic, with eye drops, or surgery can be performed. Until the 80´s pterygium ressection leaving an area of bare sclera was the main surgic procedure but it led to high rates of recurrency. Since then, adjuvants techniques have been studied in order to improve the results by decreasing recurrency rates. The aim of this paper is to try to identify, among several adjuvant procedures, which would be the best to avoid recurrency. To acomplish that we performed a network metanalisis. After critical search in data bases we selected 24 randomized clinical trials that included 1815 eyes of 1668 patients. We were able to compare the following adjuvant treatments to bare sclera technique: use of 5-Fluorouracil (5-FU), Bethaterapy, Mytomicyn C (MMC) in different concentrations, Cyclosporine, Amniotic Membrane Transplantation (AMT) and Conjunctival Autograft (CAG) alone or associated to Bevacizumab, MMC and Cyclosporine. The following direct comparisons were made: bar esclera versus bar esclera + Ciclosporyne eye drops 0.05%, conjunctival autograft versus bar esclera + intraoperative MMC 0.02%, conjunctival autograft versus amniotic membrane transplantation, bare sclera versus bar esclera + intraoperative MMC 0.02% and conjunctival autograft versus bare sclera with better results, respectivelly, in: bare sclera + Ciclosporyne 0.05% eye drops, conjunctival autograft, conjunctival autograft, bare sclera + MMC 0.02% and conjunctival autograft. Regarding the network metanalysis, the rank from best to worst treatment is: conjunctival autograft + Ciclosporyne eye drops 0.05%, bare sclera + MMC < 0.02%, bare sclera + Betatherapy (2500 cGy single dose), conjunctival autograft + Betatherapy (1000 cGy single dose), bare sclera + MMC 0.02% eye drops, conjunctival autograft, bare sclera + intraoperative MMC > 0.02%, bare sclera + Ciclosporyne eye drops 0.05%, bare sclera + intraoperative 5FU 5%, amniotic membrane transplantation, bare sclera + intraoperative MMC 0.02%, conjunctival autograft + Bevacizumab eye drops 0.05%, bare sclera + Bevacizumab eye drops 0.05% and bare sclera alone. In conclusion, given the numerous possible combinations of treatment for pterygium, it is possible to establish from the techniques compared in published clinical trials and availability of resources in each service, treatment with lower recurrence.

As poliaminas são essenciais para o controle dos mecanismos celulares nos seres vivos. A Migalina é uma acilpoliamina isolada de A. gomesiana com atividade microbicida contra E. coli, contudo, seu efeito imunomodulador é desconhecido. Sabendo que os mediadores imunes produzidos por macrófagos são críticos para a regulação da resposta imune, investigamos o efeito in vitro da Migalina sobre estas células. Demonstramos que a Migalina não induziu citotoxicidade, mas ativou iNOS, potencializando a síntese de nitrito. Aumentou a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, mas não de IL-12p40. IL-1<font face=\"Symbol\">b não foi detectada. Além disto, Inibiu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-12p40 induzida por LPS e quando associada à Polimixina B não alterou a síntese de TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrófagos deficientes de MyD88 não produziram TNF-<font face=\"Symbol\">a em resposta a Migalina, sugerindo que a sinalização mediada por TLR via MyD88 é requerida para a produção desta citocina. Comprovamos que a Migalina modula a atividade de macrófagos através de mediadores da resposta imune inata e pode ser explorada como estratégia no controle de infecções. / Polyamines are present in most living organisms. Mygalin is an acylpolyamine isolated from A. gomesiana that showed microbicide activity against E. coli, however, its immunomodulator effect has not been explored. Immune mediators produced by macrophages are essential for the regulation of immune responses. Our results showed that murine macrophages stimulated in vitro with Mygalin didnt induce cytotoxicity, but activated iNOS, inducing nitrite synthesis. The production of TNF-<font face=\"Symbol\">a was enhanced, but IL-12p40 was not. The presence of IL-1<font face=\"Symbol\">b was not detected. In higher concentrations, Mygalin inhibited significantly the production of IL-12p40 and TNF-<font face=\"Symbol\">a induced by LPS, and its association with Polymixine B did not altered the production profile of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrophages deficient in MyD88 molecule activated with Mygalin did not induce the synthesis of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Our results showed that Mygalin is capable of modulating the macrophage activity by inducing mediators of innate immune response and can be explored as a strategy in the studies to control pathogen infections.

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T13:38:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 271254.pdf: 980179 bytes, checksum: b39c20bd2905add945e031ef2820062f (MD5) / O efeito dos polissacarídeos sulfatados (PS), extraídos da macroalga Gracilaria birdiae, foi testado sobre a imunocompetência do camarão Litopenaeus vannamei através da alimentação dos animais com ração contendo 0,3% de PS, seguido por desafio experimental com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) (0,35 DL50). A hemolinfa foi coletada nos dias 0, 3 e 14 pós-infecção com WSSV e utilizada para avaliar alguns parâmetros hemato-imunológicos. Os resultados sugerem uma aparente estimulação da atividade da fenoloxidase e da capacidade aglutinante no dia 14 pós-infecção. O número total de hemócitos (CTH) diminuiu (40%) nos camarões alimentados com a dieta controle (sem PS), mas manteve-se estável nos animais tratados com PS. A porcentagem de hemócitos granulares diminuiu (30%) em todos os grupos desafiados, independentemente da presença de PS. Esses resultados sugerem uma estimulação na produção de hemócitos hialinos associada ao tratamento com PS, uma vez que a CTH não foi alterada. Além disso, verificou-se um aumento na atividade da a2-macroglobulina e na produção de ânion superóxido em todos os camarões infectados (dias 3 e 14) independente do tratamento com PS. Embora a dieta contendo PS não tenha resultado em imunoestimulação importante nos camarões, os animais desafiados com WSSV apresentaram uma diminuição (11%) na mortalidade quando tratados com PS, em comparação aos da dieta controle. Curiosamente, o vírus não foi detectado nos animais desafiados com WSSV a partir do dia 3. Acredita-se que esse achado esteja relacionado ao fenômeno de interferência viral, já que os animais apresentaram-se infectados de forma latente pelo vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética (IHHNV). Estudos futuros devem ser realizados para esclarecer tal fenômeno, bem como a atuação dos PS de G. birdiae na sobrevivência dos animais.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T16:54:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Tiana Figueiredo.pdf: 1325713 bytes, checksum: 63568b1c8914bc029fbb0ecf80e03c2a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T16:54:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Tiana Figueiredo.pdf: 1325713 bytes, checksum: 63568b1c8914bc029fbb0ecf80e03c2a (MD5) / FAPESB; RENORBIO / O ácaro de poeira doméstica Blomia tropicalis é encontrado em regiões tropicais e subtropicais da América, Europa e Ásia, sendo um das mais importantes fontes de aeroalérgenos nestas regiões. Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de um modelo experimental de alergia a B. tropicalis e sua utilização em estudos de imunoprofilaxia. Para isto, quatro linhagens de camundongos foram sensibilizadas e desafiadas com extrato de B. tropicalis (Bt) sendo considerados como marcadores de inflamação pulmonar e de resposta Th2 a elevação do número de leucócitos, da atividade de peroxidase de eosinófilos e de IL-4 no lavado bronqueoalveolar (BAL) e da atividade de peroxidase de eosinófilos no pulmão, bem como elevação de IgE sérica específica para Bt. A linhagem A/J foi considerada a mais sensível a inflamação pulmonar induzida pelo sendo utilizada nas análises subseqüentes. O modelo de alergia experimental ao B. tropicalis foi utilizado então para a investigação do efeito da imunização com adjuvantes em desempenhar papel protetor ao desenvolvimento da alergia experimental. Entre os diversos candidatos a adjuvantes testados destacaram-se a saponina e o CpG emulsionados em montanide ISA 720 por proteger os animais da inflamação pulmonar induzida pela sensibilização com Bt, embora a resposta imune estimulada por esses adjuvantes seja aparentemente mista com produção de citocinas Th1 e Th2. Visando a utilização de um antígeno mais purificado partimos para o fracionamento do Bt por cromatografia líquida de troca iônica. As frações obtidas foram inicialmente analisadas quanto ao papel hipersensibilizante para o ser humano, através de dosagem de IgE específica para cada fração obtida no soro de indivíduos com teste cutâneo positivo para B. tropicalis e em indivíduos controle. A fração que apresentou maior reatividade frente aos soros positivos (74,3%) foi utilizada no modelo murino como agente sensibilizante. Observamos então que a fração do Bt utilizada foi efetiva em promover resposta inflamatória pulmonar em alguns dos critérios analisados, no entanto não foi observada produção de IL-4 no BAL nem IgE específica nos animais. A sensibilização com B. tropicalis induziu em camundongos o desenvolvimento de doença inflamatória pulmonar análoga a asma humana. Oligonucleotídeos CpG e a saponina mostraram-se promissores candidatos a adjuvantes em formulações de vacinas. O fracionamento do extrato de B. tropicalis produziu frações reativas a IgE humana e capazes de promover inflamação pulmonar murina, sendo um bom caminho para a obtenção de antígenos mais purificados. / Salvador

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 haroldo_junior_ioc_dout_2015.pdf: 2633312 bytes, checksum: 02a75ad07873abdb519b939eb64b351c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da Hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (A1(OH)3) e o adjuvante a base de saponina. A formulação VP1+A1(OH)3 induziu polarização da resposta Th2, enquanto que a formulação VP1r+saponina gerou um balanço maior entre as respostas Th1 e Th2. O adjuvante saponina permitiu a administração de uma dose menor da VP1 sem afetar a intensidade da resposta. Resultados preliminares sugerem que os anticorpos anti-VP1 induzidos pela formulação com saponina apresentaram reatividade cruzada com o HAV. Além disso, testes iniciais indicam que os camundongos imunizados com a VP1 em associação com ambos os adjuvantes apresentaram resposta anamnéstica contra o HAV. Os resultados aqui apresentados sugerem que a VP1 e as VLPs podem ser úteis para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a Hepatite A / The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and has low yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coli expression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coliderived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant. The VP1+Al(OH)3 induced Th2 polarization, while VP1+saponin generated a Th1 and Th2 balanced immune response. Saponin-based adjuvant formulations allowed the administration of lower dose of VP1 without affecting the intensity of the response. Preliminary results suggest that the anti-VP1 antibodies induced by saponin-based adjuvant showed cross-reactivity with HAV. Furthermore, initial tests indicate that immunization of mice with VP1 in association with both adjuvants generated anamnestic response against HAV. The results presented here suggest that VP1 and VLPs might be useful to develop a new vaccine against hepatitis A. / 2016-07-10

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