A digoxina é um medicamento usado para tratar distúrbios cardíacos, com janela terapêutica muito estreita. Para combater seu efeito tóxico, fragmentos Fab do anticorpo policlonal anti-digoxina estão disponíveis comercialmente. Nosso objetivo foi a obtenção de variantes de fragmentos Fab do anticorpo monoclonal anti-digoxina usando a tecnologia phage display, que permite gerar fragmentos de anticorpos de alta afinidade e especificidade. Uma biblioteca combinatória de fragmentos Fab anti-digoxina foi construída no vetor pComb3X a partir do RNA total do hibridoma anti-digoxina. Seis clones foram isolados, todos com sequência idêntica na cadeia pesada. A cadeia leve apresentou 2 clones idênticos, um pseudogene e um clone com um aminoácido distinto no CDR2. Quatro clones apresentando variações na sequência do framework1 da cadeia leve foram expressos como fragmentos Fab solúveis. Todos apresentaram ligação à digoxina-BSA por ELISA e Western blotting. A ligação específica do anticorpo também foi confirmada pelo BIAcore, que permitiu ranqueamento entre os clones. / Digoxin is a pharmaceutical used in the control of cardiac dysfunction. Its therapeutic window is very narrow. To counteract the toxic effect, polyclonal anti-digoxin Fab fragments are commercially available. Our goal was to obtain variants of monoclonal anti-digoxin Fab fragments by phage display technology, which allows the generation of high affinity and specificity antibody fragments. Anti-digoxin Fab fragments combinatorial library was constructed into pComb3X vector from total RNA of anti-digoxin hybridoma. Six clones were isolated and the heavy chain presented the same sequence. For the light chain, 2 clones were identical, one was a pseudogene and other one presented a distinct amino acid in the CDR2. Four clones presenting variations in the framework 1 were induced to express soluble Fab fragments, all positive for anti-digoxin binding in ELISA assays and Western blotting. The specific binding of the antibody was further confirmed by BIAcore, which allowed ranking of the clones.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11062012-083314 |
| Date | 27 March 2012 |
| Creators | Murata, Viviane Midori |
| Contributors | Moro, Ana Maria, Tsuruta, Lilian Rumi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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