Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2151.pdf: 1524860 bytes, checksum: 6ed528476d44762b88988e6b1ca76146 (MD5) Previous issue date: 2004-08-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of the technology of animal cell culture for the expression of recombinant proteins has been gaining major interest within biotechnology due the obtation of recent efficient medicaments in the chronic diseases. In this work was utilized the recombinant lineage CHO-K1, denominate CHOZMD, anchorage-dependent. It is capable of expressing a disintegrin with antimetastics properties. Knowing the precedent of well performance of fixed bed bioreactors with utilization of microcarriers in large scale animals cells cultures. It was fixed as purpose of this work the definition of a method to prepare of inoculum to this bioreactor utilizing Cytoline 1 commercial macroporous microcarrier in spinner flask. The cultures realized in spinner flasks of 500 mL with Cytoline 1 microcarriers with DMEM medium in range of pH in 7.0 to 7.4. It showed that the electrostatic incompatibility between the cell and the microcarrier matrix composed of polyethylene and silica was responsible by decreased adhesion cell and, consequently, by intense cell death for firsts hours of experiments. In function this was necessary to utilize an inoculum with high cell concentration and a better pH medium control to reach satisfactory results in the culture. Following this strategy was possible to achieve highest maximum specific growth cell rate (μmáx) for the CHOZMD cell of 0.24d-1 while for wild CHO-K1 cell was obtained 0.36d-1, both comparable with other works encounter in the literature. The best value obtained of cell productivity with recombinant cell was of 6,096 cel/mL·h and for wild cell was of 10,596 cel/mL·h The lager concentrations of adherents cells on microcarriers were obtained in this experiments that utilized concentrated inoculums, in the case of recombinant cell was obtained 1.39·106 cel/mL and in the case with wild cell of 1.65·106 cel/mL. For the preparation of an inoculum for a fixed bed bioreactor when prepared in spinner with Cytoline 1 microcarrier recommend: adoption of an inoculum approximate of 2.0·106 cel/mL in exponential growth phase and with rigorous control of pH medium in 7.3. / O uso da tecnologia de cultivo de célula animal para a expressão de proteínas recombinantes vem ganhando interesse crescente dentro da biotecnologia em função da obtenção de novos medicamentos eficientes no tratamento de doenças crônicas. Neste trabalho foi utilizada a linhagem recombinante CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary), denominada CHOZMD, dependente de ancoramento. Capaz de expressar uma desintegrina com propriedades antimetastáticas. Conhecendo os precedentes de bom desempenho do biorreator de leito fixo com utilização de microcarregadores no cultivo de células animais em larga escala fixou-se como objetivo deste trabalho a definição de um método para preparo de inóculo para esse biorreator utilizando o microcarregador macroporoso comercial Cytoline 1 em frasco spinner. Os cultivos realizados em frasco spinner de 500 mL com microcarregadores Cytoline 1 em meio DMEM em pH variando entre 7,0 e 7,4 mostraram que a baixa compatibilidade entre a célula e a matriz do microcarregador composta de polietileno e sílica foi responsável pela baixa adesão celular. Em função disso foi necessário utilizar um inóculo com alta concentração celular e um melhor controle do pH do meio para alcançar resultados satisfatórios nos cultivos. Seguindo essa estratégia foi possível conseguir velocidades específicas máximas de crescimento celular (μmáx) para a célula CHOZMD de 0,24d-1 enquanto que para a célula CHO-K1 selvagem obteve-se 0,36d-1, ambas comparáveis as de outros trabalhos encontrados na literatura. O melhor valor obtido de produtividade celular com célula recombinante foi de 6.096 células/mL·h e para a célula selvagem foi de 10.569 células/mL·h. As maiores concentrações de células aderidas aos microcarregadores foram obtidas nos experimentos que utilizaram inóculos concentrados, no caso da célula recombinante obteve-se 1,39·106 células/mL e no caso com célula selvagem 1,65·106 células/mL. Para o preparo de um inóculo adequado para um biorreator de leito fixo quando preparado no spinner com microcarregador Cytoline 1 recomenda-se a adoção de um inóculo em torno de 2,0·106 células/mL na fase exponencial de crescimento e controle rigoroso do pH do meio em 7,3.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim Alvarenga / Banca: Eunice Oba / Banca: Mateus José Sudano / Resumo: O sistema de cultivo in vitro de embriões apresenta menor eficiência em relação ao in vivo, sendo caracterizado por menores taxas de desenvolvimento e de adesão, além de uma menor tolerância à certas alterações que provocam estresse, como agentes físicos, químicos, térmicos, osmóticos, oxidativos, radioativos, entre outros. De acordo com a intensidade do estresse, pode-se estimular uma resposta celular favorecendo o desenvolvimento embrionário, adquirindo maior tolerância através de aceleração no metabolismo, proliferação e crescimento celular. O objetivo do presente trabalho foi analisar o efeito do estresse óptico em diferentes momentos ao longo do cultivo e conhecer as possíveis aplicações, a partir do estresse subletal e da bioestimulação promovida pela irradiação com diodo emissor de luz (LED). Com isto, os resultados demonstraram que em alguns estágios do desenvolvimento embrionário, tal como em blastocistos, o uso do estresse óptico pode ser benéfico ao embrião, protegendo-o de eventos como a apoptose. Os principais resultados demonstram que na produção de blastocistos houve aumento na produção dos mesmos nos grupos irradiados, apesar de não haver diferença estatística (Controle 23,2; IRD3inf 31,3; IRD6Infra 33,3). O estímulo por LED prévio à vitrificação mostrou que a irradiação por infravermelho em D3 pode estimular o aumento, em média, do numero de células (Controle: 91,9; IRD3inf: 112,8). Em relação às células apoptóticas, grupos irradiados com luz infravermelha mostraram menos número de células envolvidas neste processo (Controle: 11,6; IRD6inf: 6,6; IRFIVinf: 7,8), e a irradiação por luz vermelha pareceu aumentar a apoptose (IRD3verm: 15,6; IRD6verm: 16,1). Em relação à taxa de reexpansão, o a irradiação por luz vermelha teve efeito sobre o grupo irradiado em D3, mostrando uma diminuição significativa para o mesmo (Controle: 70,5 IRD3 verm; 39,3). De ... / Abstract: The in vitro embryo culture system has lower efficiency compared to in vivo, because the in vitro system is characterized by lower rates of development, deployment, and a lower tolerance to certain changes that cause stress, such as physical, chemical, thermal, osmotic, oxidative and radioactive among others. According to the stress intensity it is possible to stimulate a cellular response promoting embryonic development and acquiring greater tolerance by the acceleration of metabolism, cell proliferation and growth. The objective of this study was to analyze the effect of the optical stress at different periods throughout the embryo development and understand the possible applications for this stimulation, from sublethal stress and biostimulation promoted by irradiation with lasers. Therefore, the results showed that optical stress can be beneficial to the embryos at certain stages of their development, such as blastocysts stage, protecting them from apoptosis. The main results show that an increase in blastocysts production for infrared irradiated groups, although there was no statistical difference (control 23.2; IRD3inf 31.3; IRD6Inf 33.3). The infrared LED stimulus prior to vitrification showed a higher number of cells for embryos in D3 (control: 91.9; IRD3inf: 112.8). Also, infrared irradiation appeared to decrease the number of apoptotics cells, when compared to controls (control: 11.6; IRD6inf: 6.6; IRFIVinf: 7.8), and red light irradiation appeared to increase apoptosis (IRD3verm: 15.6; IRD6verm: 16.1). Regarding re-expansion rate, the red light irradiation in D3 is related a significant decrease in the rate (control: 70.5; IRD3verm: 39.3). According to the results, irradiation with infrared light effect is shown in blastocyst production, which is economically important to embryos IVP. Moreover, the apoptosis analysis showed that the association between the techniques applied in this study are important for the in ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-06Bitstream added on 2014-11-10T11:57:44Z : No. of bitstreams: 1 000784225.pdf: 760734 bytes, checksum: c70c8782d6352b14ba371a32c3549c66 (MD5) / O sistema de cultivo in vitro de embriões apresenta menor eficiência em relação ao in vivo, sendo caracterizado por menores taxas de desenvolvimento e de adesão, além de uma menor tolerância à certas alterações que provocam estresse, como agentes físicos, químicos, térmicos, osmóticos, oxidativos, radioativos, entre outros. De acordo com a intensidade do estresse, pode-se estimular uma resposta celular favorecendo o desenvolvimento embrionário, adquirindo maior tolerância através de aceleração no metabolismo, proliferação e crescimento celular. O objetivo do presente trabalho foi analisar o efeito do estresse óptico em diferentes momentos ao longo do cultivo e conhecer as possíveis aplicações, a partir do estresse subletal e da bioestimulação promovida pela irradiação com diodo emissor de luz (LED). Com isto, os resultados demonstraram que em alguns estágios do desenvolvimento embrionário, tal como em blastocistos, o uso do estresse óptico pode ser benéfico ao embrião, protegendo-o de eventos como a apoptose. Os principais resultados demonstram que na produção de blastocistos houve aumento na produção dos mesmos nos grupos irradiados, apesar de não haver diferença estatística (Controle 23,2; IRD3inf 31,3; IRD6Infra 33,3). O estímulo por LED prévio à vitrificação mostrou que a irradiação por infravermelho em D3 pode estimular o aumento, em média, do numero de células (Controle: 91,9; IRD3inf: 112,8). Em relação às células apoptóticas, grupos irradiados com luz infravermelha mostraram menos número de células envolvidas neste processo (Controle: 11,6; IRD6inf: 6,6; IRFIVinf: 7,8), e a irradiação por luz vermelha pareceu aumentar a apoptose (IRD3verm: 15,6; IRD6verm: 16,1). Em relação à taxa de reexpansão, o a irradiação por luz vermelha teve efeito sobre o grupo irradiado em D3, mostrando uma diminuição significativa para o mesmo (Controle: 70,5 IRD3 verm; 39,3). De ... / The in vitro embryo culture system has lower efficiency compared to in vivo, because the in vitro system is characterized by lower rates of development, deployment, and a lower tolerance to certain changes that cause stress, such as physical, chemical, thermal, osmotic, oxidative and radioactive among others. According to the stress intensity it is possible to stimulate a cellular response promoting embryonic development and acquiring greater tolerance by the acceleration of metabolism, cell proliferation and growth. The objective of this study was to analyze the effect of the optical stress at different periods throughout the embryo development and understand the possible applications for this stimulation, from sublethal stress and biostimulation promoted by irradiation with lasers. Therefore, the results showed that optical stress can be beneficial to the embryos at certain stages of their development, such as blastocysts stage, protecting them from apoptosis. The main results show that an increase in blastocysts production for infrared irradiated groups, although there was no statistical difference (control 23.2; IRD3inf 31.3; IRD6Inf 33.3). The infrared LED stimulus prior to vitrification showed a higher number of cells for embryos in D3 (control: 91.9; IRD3inf: 112.8). Also, infrared irradiation appeared to decrease the number of apoptotics cells, when compared to controls (control: 11.6; IRD6inf: 6.6; IRFIVinf: 7.8), and red light irradiation appeared to increase apoptosis (IRD3verm: 15.6; IRD6verm: 16.1). Regarding re-expansion rate, the red light irradiation in D3 is related a significant decrease in the rate (control: 70.5; IRD3verm: 39.3). According to the results, irradiation with infrared light effect is shown in blastocyst production, which is economically important to embryos IVP. Moreover, the apoptosis analysis showed that the association between the techniques applied in this study are important for the in ...

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3855.pdf: 4228860 bytes, checksum: d98f3c071d7a0193e713fbb5f00c1b41 (MD5) Previous issue date: 2011-08-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / The mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent stem cells that can differentiate into various types of tissue, a characteristic that makes them interesting for applications in cell therapy. Moreover, cells are anchorage-dependent (ability to adhere to surfaces), easy isolation and rapid expansion in vitro. The traditional cultures of anchorage-dependent animal cells, usually grown in monolayers, resulting in low crop yield and cell recovery, preventing the use of MSCs in therapeutic applications. The need for alternative farming techniques for expansion of MSCs in a large scale have led researchers to the use of "bioreactor technology," which has been seconded from the bioreactor, spinner flask with microcarriers and hollow fiber (hollow fiber). The objective of this work was to develop a method of cultivation known as mesenchymal stem cell line hMSC-TERT in spinner flasks with microcarriers for subsequent inoculation into hollow-fiber bioreactor, aiming at the efficient expansion and the subsequent recovery of MSCs so that preserve their differentiation potential in order to be used in cell therapy. In cultured, we used the microcarrier Pronectin ® F 100 mL spinner flasks with culture medium α-MEM with 15% fetal calf serum, kept in a CO2 incubator at 37 ° C and pH between 7.2 and 7.4. In cultures in spinner flasks were adopted strategies such as supplementation of the culture medium, exchanges of culture medium during cultivation, addition of reagents to reduce clusters of microcarriers, to increase productivity for the subsequent cell inoculation in hollow fiber bioreactor. The use of these strategies has increased productivity cell, achieving a best result of cell multiplication factor (MCF) of 5.79. However, obtaining higher FMC was drastically limited by the formation of clusters of microcarriers in a gel matrix.The cell recovery was low maintenance and analysis of the antigenic phenotype by flow cytometry confirmed the conservation of phenotypic characteristics of hMSC-TERT. The hollow fiber bioreactor is an alternative to the clusters of microcarriers, it allows oxygenation and adequate supply of nutrients. Thus, in experiments carried out in hollow-fiber bioreactor used the α-MEM supplemented with 15% FBS (v / v), 2.0 g / L glucose, 2.50 mM glutamine, 2.60 mM arginine, 0.07% antifoam PPG. The cells were inoculated after 48 hours of cultivation in spinner flasks in a gel composed of collagen, hyaluronic acid, agar (1.5%) in the proportion 0.75: 0.037: 0.21 at pH 7.2 to 7.4 . Thus, the resulting gel was mixed with culture medium in α-MEM 1:3 ratio, to provide better grip on the fibers. The total expansion factor, ie the one calculated from the inoculation of the spinner to the end of cultivation in hollow fiber bioreactor was 11, 2, which can be considered the greatest value achieved in this work. It is clear that this expansion factor can still be easily overcome by adopting strategies to grow more frequent replacement of culture medium. This hypothesis is strengthened by the proven fact that the microcarriers are not yet saturated with cells at the end of the experiment. / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células-tronco multipotentes que podem se diferenciar em diversos tipos de tecido, característica que as torna interessantes em aplicações de terapia celular. Além disso, são células dependentes de ancoramento (capacidade de aderir em superfícies), de fácil isolamento e de rápida expansão in vitro. As culturas tradicionais de células animais dependentes de ancoramento, geralmente cultivadas em monocamadas, resultam em baixo rendimento de cultivo e de recuperação celular, inviabilizando o uso das CTMs em aplicações terapêuticas. A necessidade de técnicas de cultivo alternativas para expansão de CTMs em larga escala têm levado pesquisadores à utilização de tecnologia de biorreatores , na qual tem-se destacado dos biorreatores: frasco spinner com microcarregadores e hollow fiber (fibra oca). Assim, o objetivo deste trabalho foi o de desenvolver uma metodologia de cultivo da linhagem de CTM conhecida como hMSC-TERT em frasco spinner com microcarregadores para posterior inoculação em biorreator de fibraoca, visando a expansão eficiente e a posterior recuperação das CTMs de tal forma que, preservassem seu potencial de diferenciação para poderem ser utilizadas na terapia celular. Nos cultivos, utilizou-se o microcarregador Pronectin®F em frasco spinner de 100 mL com o meio de cultura α-MEM com 15% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora de CO2 a 37ºC e pH entre 7,2 e 7,4. Nos cultivos em frasco spinner adotaram-se estratégias como suplementação do meio de cultura, trocas de meio de cultura durante o cultivo, adição de reagentes para diminuição de aglomerados de microcarregadores, visando aumentar a produtividade celular para a posterior inoculação em biorreator de fibra oca. A utilização dessas estratégias permitiram aumentar a produtividade celular, obtendo-se como melhor resultado um fator de multiplicação celular (FMC) de 5,79. Contudo, a obtenção de FMC maiores foi drasticamente limitada pela formação de aglomerados de microcarregadores num gel de matriz extracelular. A recuperação celular foi baixa e a análise da manutenção do fenótipo antigênico por citometria de fluxo comprovaram a conservação das características fenotípicas da hMSC-TERT. O biorreator de fibras ocas é uma alternativa em relação aos aglomerados de microcarregadores, pois permite a oxigenação e suprimento adequado de nutrientes. Sendo assim, nos experimentos realizados no biorreator de fibras-ocas utilizou-se o α-MEM suplementado com 15% SFB (v/v), 2,0 g/L de glicose, 2,50 mM de glutamina, 2,60 mM de arginina, 0,07 % do antiespumante PPG. As células foram inoculadas após 48 horas de cultivo em frasco spinner em um gel composto por colágeno: ácido hialurônico: ágar (1,5%) na proporção 0,75: 0,037: 0,21 em pH = 7,2-7,4. Assim, o gel resultante foi misturado com meio de cultura α-MEM na proporção 1:3, para proporcionar melhor aderência nas fibras. O fator de expansão total, ou seja, aquele calculado desde a inoculação do spinner até o final do cultivo no biorreator de fibra oca, foi de 11, 2, que pode ser considerado o maior valor atingido neste trabalho. Convém esclarecer que este fator de expansão ainda pode ser facilmente superado ao se adotarem estratégias de cultivo com trocas mais frequentes de meio de cultura. Esta hipótese é reforçada pelo fato comprovado de os microcarregadores ainda não estarem saturados de células no final do experimento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissDF.pdf: 699670 bytes, checksum: 3b6ce911fe1da5141ad8e34545247e79 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the last two decades mammalian cell cultures have been broadly used for the industrial production of pharmaceutical, proteins, in particular the monoclonal antibodies by cultures of murine hybrid cells (hybridoma). The development of bioprocess for industrial scale of monoclonal antibodys (MAbs) depends on the determination and optimization of several physiological and metabolic parameters. In this work are shown preliminary development results of the bioprocess for production of three MAbs for blood typing through the ABO system, with is of great interest for Brazilian public health. Experiments with three lineages of murine hybridomas which were able to secret three different immunoglobulins with specificity to ABO human blood antigens were accomplished in Spinner flasks using RPMI 1640 medium and fetal bovine serum (FBS) in concentrations of 20 and 10 % vv, temperature of 37 ºC and pH 6.8 7.4 .The three hybridomas showed very different growth patterns in these culture medium The cultivation with 20 % v/v of FBS as much as the cultivation with cells adapted to 10 % v/v FBS showed the necessity of a better balance of the amino acids formulation in the culture medium in order to improve the specific maximum grow rate (µmáx) and maximum cells density (CXmáx). / Nas últimas duas décadas o cultivo de células animais tem sido amplamente utilizado para a produção industrial de proteínas de interesse farmacêutico em particular de anticorpos monoclonais, através do cultivo de células híbridas murinas (hibridomas). O desenvolvimento de bioprocessos de alta produtividade em larga escala de produção de anticorpos monoclonais (MAbs monoclonal antibodys) depende da determinação e otimização de vários parâmetros fisiológicos e metabólicos dos hibridomas. Neste trabalho são apresentados dados preliminares para o desenvolvimento de um bioprocesso de produção de três MAbs para tipagem sanguínea pelo sistema ABO, de grande interesse para a saúde pública Brasileira. Experimentos com três linhagens de hibridomas murinos capazes de secretar imunoglobulinas com especificidade a antígenos eritrocitários do sistema sanguíneo ABO humano foram realizados em frascos Spinner usando meio RPMI 1640 e soro fetal bovino (SFB) em concentrações de 20 e 10 % v/v, temperatura de 37 ºC e pH 6,8 7,4. Os três hibridomas mostraram características de crescimento celular bem diferenciadas nesse meio de cultura. Tanto os cultivos com 20 % v/v de SFB como os cultivos com células adaptadas a 10 % v/v SFB revelaram a necessidade de balanceamento de aminoácidos no meio para melhorar a velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx) e densidade máxima de células (CXmáx).