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Desenvolvimento de processo de inoculação com microcarregador Cytoline 1 visando o cultivo de célula CHO-K1 em biorreator de leito fixoQuerino, Marcelo Vargas 20 August 2004 (has links)
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Previous issue date: 2004-08-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of the technology of animal cell culture for the expression of recombinant proteins has been gaining major interest within biotechnology due the obtation of recent efficient medicaments in the chronic diseases. In this work
was utilized the recombinant lineage CHO-K1, denominate CHOZMD, anchorage-dependent. It is capable of expressing a disintegrin with antimetastics properties. Knowing the precedent of well performance of fixed bed bioreactors with utilization of microcarriers in large scale animals cells cultures. It was fixed as purpose of this work the definition of a method to prepare of inoculum to this bioreactor utilizing Cytoline 1 commercial macroporous microcarrier in spinner flask. The cultures realized in spinner flasks of 500 mL with Cytoline 1
microcarriers with DMEM medium in range of pH in 7.0 to 7.4. It showed that the electrostatic incompatibility between the cell and the microcarrier matrix composed of polyethylene and silica was responsible by decreased adhesion cell and, consequently, by intense cell death for firsts hours of experiments. In function this was necessary to utilize an inoculum with high cell concentration and a better pH medium control to reach satisfactory results in the culture. Following this strategy was possible to achieve highest maximum specific growth cell rate (μmáx) for the CHOZMD cell of 0.24d-1 while for wild CHO-K1 cell was obtained 0.36d-1, both comparable with other works encounter in the literature.
The best value obtained of cell productivity with recombinant cell was of 6,096 cel/mL·h and for wild cell was of 10,596 cel/mL·h The lager concentrations of adherents cells on microcarriers were obtained in this experiments that utilized
concentrated inoculums, in the case of recombinant cell was obtained 1.39·106 cel/mL and in the case with wild cell of 1.65·106 cel/mL. For the preparation of an inoculum for a fixed bed bioreactor when prepared in spinner with Cytoline 1
microcarrier recommend: adoption of an inoculum approximate of 2.0·106 cel/mL in exponential growth phase and with rigorous control of pH medium in 7.3. / O uso da tecnologia de cultivo de célula animal para a expressão de proteínas recombinantes vem ganhando interesse crescente dentro da biotecnologia em função da obtenção de novos medicamentos eficientes no tratamento de doenças crônicas. Neste trabalho foi utilizada a linhagem
recombinante CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary), denominada CHOZMD, dependente de ancoramento. Capaz de expressar uma desintegrina com propriedades antimetastáticas. Conhecendo os precedentes de bom desempenho do biorreator de leito fixo com utilização de microcarregadores no cultivo de células animais em larga escala fixou-se como objetivo deste trabalho a definição de um método para preparo de inóculo para esse biorreator utilizando o microcarregador macroporoso comercial Cytoline 1 em frasco spinner. Os cultivos realizados em frasco spinner de 500 mL com microcarregadores Cytoline 1 em meio DMEM em pH variando entre 7,0 e 7,4 mostraram que a baixa compatibilidade entre a célula e a matriz do microcarregador composta de polietileno e sílica foi responsável pela baixa adesão celular. Em função disso foi necessário utilizar um inóculo com alta concentração celular e um melhor controle
do pH do meio para alcançar resultados satisfatórios nos cultivos. Seguindo essa estratégia foi possível conseguir velocidades específicas máximas de crescimento celular (μmáx) para a célula CHOZMD de 0,24d-1 enquanto que para a célula CHO-K1 selvagem obteve-se 0,36d-1, ambas comparáveis as de outros trabalhos encontrados na literatura. O melhor valor obtido de produtividade celular com célula recombinante foi de 6.096 células/mL·h e para a célula selvagem foi de 10.569 células/mL·h. As maiores concentrações de células aderidas aos microcarregadores foram obtidas nos experimentos que utilizaram inóculos concentrados, no caso da célula recombinante obteve-se 1,39·106 células/mL e no caso com célula selvagem 1,65·106 células/mL. Para o preparo de um inóculo adequado para um biorreator de leito fixo quando preparado no spinner com
microcarregador Cytoline 1 recomenda-se a adoção de um inóculo em torno de 2,0·106 células/mL na fase exponencial de crescimento e controle rigoroso do pH do meio em 7,3.
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Obtenção de antígeno viral a partir de culturas de células vero em microcarregadores porosos / Obtention of viral antigens from the Vero cell cultures on porous microcarriers.Yokomizo, Adriana Yurie 28 March 2001 (has links)
Cultivos de células VERO em microcarregadores porosos de celulose (Cytopore) e porosos de gelatina (Cultispher G) com rendimento celular três vezes maior, foram obtidos em relação às culturas em microcarregadores sólidos de DEAE-dextran (Cytodex tipo 1). No Cytopore e Cultispher G atingimos 1.265 e 1.103 células/microcarregador, respectivamente e no Cytodex 1, 256 células/microcarregador. A concentração celular nos suportes porosos Cytopore aumentou 43 vezes o número de células iniciais, 37,5 vezes no Cultispher G e 17 vezes no Cytodex 1. As culturas de células VERO nos microcarregadores porosos foram utilizadas com êxito para a replicação do vírus rábico (PV/VERO), quando infectadas com MOI de 0,05. Títulos de 104,8 FFD50/mL determinados pelo método de inibição de focos fluorescentes (RFFIT) foram obtidos 96 horas após a infecção. Estudos de microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão para análise da estrutura destes suportes, mostraram boa colonização celular e a eficiência da replicação viral. A padronização de metodologia para cultura e infecção viral de células VERO nos microcarregadores porosos indica a utilidade destes suportes para produção de antígenos e vacinas virais e a potencialidade do sistema para a obtenção de produtos biotecnológicos em geral. / Cultures of VERO cell on porous cellulose-coated microcarriers (Cytopore) and on porous gelatin-coated (Cultispher G) with a cellular yield 3 times higher, was obtained in relation to DEAE-dextran solid microcarriers (Cytodex type 1). In the cultures on Cytopore and Cultispher G we obtained 1.265 and 1.103 cells/microcarrier, respectively and 256 cells/microcarrier on Cytodex 1. The cell concentration for the Cytopore porous suports increased 43 times from the initial cell number, 37,5 times for the Cultispher G and 17 times for the Cytodex 1. The VERO cell cultures on porous microcarriers were efficiently used for the replication of the rabies virus (PV/VERO), when infected with 0,05 MOI. Titers of 104,8 FFD50/mL determined by the fluorescent focus inhibition method (RFFIT) were obtained 96 hours post-infection. Studies on light microscopy and scanning and transmission eletronic microscopy carried out to analyse the suports structure, showed a good cell population and efficiency of virus infection. The standardization of a methodology for culture and virus infection of VERO cells on porous microcarriers indicate the usefulness of these porous supports to the antigens and viral vaccines production and the potenciality of this system for the attainment of biotechnological products.
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Desenvolvimento de um bioprocesso para expansão de células mesenquimais estromais multipotentes em microcarregadores / Bioprocess development for expansion of mesenchymal stem cells on microcarriers.Caruso, Sâmia Rigotto 04 May 2012 (has links)
As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.
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Desenvolvimento de um bioprocesso para expansão de células mesenquimais estromais multipotentes em microcarregadores / Bioprocess development for expansion of mesenchymal stem cells on microcarriers.Sâmia Rigotto Caruso 04 May 2012 (has links)
As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.
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Obtenção de antígeno viral a partir de culturas de células vero em microcarregadores porosos / Obtention of viral antigens from the Vero cell cultures on porous microcarriers.Adriana Yurie Yokomizo 28 March 2001 (has links)
Cultivos de células VERO em microcarregadores porosos de celulose (Cytopore) e porosos de gelatina (Cultispher G) com rendimento celular três vezes maior, foram obtidos em relação às culturas em microcarregadores sólidos de DEAE-dextran (Cytodex tipo 1). No Cytopore e Cultispher G atingimos 1.265 e 1.103 células/microcarregador, respectivamente e no Cytodex 1, 256 células/microcarregador. A concentração celular nos suportes porosos Cytopore aumentou 43 vezes o número de células iniciais, 37,5 vezes no Cultispher G e 17 vezes no Cytodex 1. As culturas de células VERO nos microcarregadores porosos foram utilizadas com êxito para a replicação do vírus rábico (PV/VERO), quando infectadas com MOI de 0,05. Títulos de 104,8 FFD50/mL determinados pelo método de inibição de focos fluorescentes (RFFIT) foram obtidos 96 horas após a infecção. Estudos de microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão para análise da estrutura destes suportes, mostraram boa colonização celular e a eficiência da replicação viral. A padronização de metodologia para cultura e infecção viral de células VERO nos microcarregadores porosos indica a utilidade destes suportes para produção de antígenos e vacinas virais e a potencialidade do sistema para a obtenção de produtos biotecnológicos em geral. / Cultures of VERO cell on porous cellulose-coated microcarriers (Cytopore) and on porous gelatin-coated (Cultispher G) with a cellular yield 3 times higher, was obtained in relation to DEAE-dextran solid microcarriers (Cytodex type 1). In the cultures on Cytopore and Cultispher G we obtained 1.265 and 1.103 cells/microcarrier, respectively and 256 cells/microcarrier on Cytodex 1. The cell concentration for the Cytopore porous suports increased 43 times from the initial cell number, 37,5 times for the Cultispher G and 17 times for the Cytodex 1. The VERO cell cultures on porous microcarriers were efficiently used for the replication of the rabies virus (PV/VERO), when infected with 0,05 MOI. Titers of 104,8 FFD50/mL determined by the fluorescent focus inhibition method (RFFIT) were obtained 96 hours post-infection. Studies on light microscopy and scanning and transmission eletronic microscopy carried out to analyse the suports structure, showed a good cell population and efficiency of virus infection. The standardization of a methodology for culture and virus infection of VERO cells on porous microcarriers indicate the usefulness of these porous supports to the antigens and viral vaccines production and the potenciality of this system for the attainment of biotechnological products.
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Expansão de células-tronco mesenquimais em frasco spinner com microcarregadoresSanches, Simone 07 October 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2010-10-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / The Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from adult tissues are at present an attractive source for applications in tissue engineering and cellular therapies. It presents a potential to differentiate into different cell lines as adipocytes, chondrocytes, osteocytes and myocytes. Due to low availability in the tissues and the fact that the demand for therapeutic applications is much larger than the supply capacity has become necessary to expand them in vitro strongly dependent on conservation of their differentiation potential. The MSCs are anchorage dependent, they have the characteristic of adhering to a solid substrate for subsequent proliferation. The conventional procedure of expansion in T-flasks with growth in monolayers, usually involves a difficult monitoring and control process, with high contamination indexi, low cell yield and high cost. In this work, we evaluated a methodology of expansion of hMSC-TERT line in spinner flask with microcarriers (small particles with properties favorable for cell adhesion and proliferation). In the experiments, two type of microcarriers were used, Cytodex 1 non-porous and with positive electric charge and Cultispher S, macroporous and electrically neutral, both in stirred spinner flask of 100 mL in culture medium α-MEM with 15% fetal calf serum, maintained in a CO2 incubator at 37°C and pH between 7.2 and 7.4. To increase productivity, some strategies were adopted during the research as a nutritional balance of the culture medium, addition of microcarriers and dilution and/or replacement of medium during cultivation. Aided by analysis of metabolites by high performance liquid chromatography and optical microscopy, the results showed that it was possible to grow hMSC-TERT with two microcarriers while maintaining good conditions for growth in three dimensions. However, the cell yield was limited mainly by the formation of clusters of microcarriers/extracellular matrix and is possible to obtain a cellular expansion factor of 4.98 with Cytodex 1 and 9,70 with Cultispher S. Because of the easy recovery of the cell showed by later microcarrier, it was performed an analysis of the maintenance of antigenic phenotype by flow cytometry and induction of differentiation into adipocytes and osteocytes. The results confirmed the conversation of phenotypic characteristics of hMSC-TERT with the cultivation technique evaluated in this work. / As Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) de tecido adulto são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e em terapias celulares. Apresentam um potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares como adipócitos, condrócitos, osteócitos e miócitos. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos e ao fato da demanda para aplicações terapêuticas ser muito maior do que a capacidade de fornecimento tornou-se necessária sua expansão in vitro fortemente condicionada à conservação do seu potencial de diferenciação. As CTMs são dependentes de ancoramento, ou seja, possuem a característica de aderir a um substrato sólido para posterior proliferação. O procedimento convencional de expansão em frascos T, com crescimento em monocamadas, geralmente envolve um processo de difícil monitoramento e controle, com maior índice de contaminação, de baixo rendimento celular e de alto custo. No presente trabalho, avaliou-se uma metodologia de expansão da linhagem hMSC-TERT em frasco spinner com microcarregadores (pequenas partículas com propriedades favoráveis para adesão e proliferação celular). Nos cultivos foram utilizados dois tipos de microcarregadores, Cytodex 1, não poroso e com carga elétrica positiva, e Cultispher S, macroporoso e eletricamente neutro, ambos em frasco spinner agitado de 100 mL, com o meio de cultura α-MEM com 15% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora de CO2 a 37ºC e pH entre 7,2 e 7,4. Para aumentar a produtividade celular, algumas estratégias foram adotadas durante a pesquisa como balanceamento nutricional do meio de cultura, adição de microcarregadores e a diluição e/ou a troca do meio durante o cultivo. Auxiliado pela análise de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência e por microscopia ótica, os resultados obtidos mostraram que foi possível cultivar as CTMs com os dois microcarregadores mantendo boas condições para o crescimento tridimensional. Contudo, o rendimento celular foi limitado, principalmente, pela formação de aglomerados de microcarregadores/matriz extracelular sendo possível obter um fator de expansão celular de 4,98 com o Cytodex 1 e de 9,70 com o Cultispher S. A fácil recuperação da célula, vantagem oferecida por este microcarregador, foi aproveitada para realizar a análise da manutenção do fenótipo antigênico por citometria de fluxo e por indução da diferenciação em adipócitos e osteócitos. Os resultados comprovaram a conservação das características fenotípicas da hMSC-TERT com a técnica de cultivo avaliada neste trabalho.
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Expansão de células mesenquimais estromais em frasco spinner e avaliação de aditivos para diminuir a aglomeração de microcarregadoresMendonça, Marlei Leandro de 29 April 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2013-04-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The increasing interest in the employment of multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) to applications in tissue engineering and cell therapy is mainly attributed to their plasticity and regenerative capacity. The MSCs represent a revolution in the treatment of countless diseases and in the understanding of tissue repair mechanisms. Due to their low availability in the tissues (0.00001% to 0.0002%) as well as to the need of high doses for therapeutic applications (approximately 2 x 106 cells/kg patient), and to the inefficiency of traditional in vitro cultures (in monolayer) to meet the existing high demand to these applications, development of new technologies of ex vivo expansion on a large scale became indispensable. The use of spinner flasks-like bioreactors with microcarriers in suspension is an effective alternative system for this expansion. However, bibliographic report of cultures with this system have indicated the formation of large clusters of microcarriers with cells as a possible obstacle to obtain a greater cellular productivity. These clusters hamper the diffusion of nutrients, gases (especially oxigen), and reagents of indirect cellular quantification within them; and they harm the cell recovery at the end of culture. Alginate microspheres have become interesting to reduce the frequency of collisions between microcarriers, due to the fact that the microspheres do not adhere to cells nor to microcarries and can prevent the union of same. The dextran sulfate has been described in the literature as an inhibitor of cell-to-cell contact as well as of the encounter between microcarriers in culture, therefore, it too has become a promising option to avoid the formation of clusters of microcarriers. Thus, the aim of this work was to develop a methodology for the culture of MSCs in spinner flasks with microcarriers Cultispher-S for application in cell therapy and evaluate the influence of alginate microspheres and dextran sulfate on this culture. For this, the lineage hMSCTERT and 3 g/L Cultispher-S were held in 100 mL spinner containing α-MEM culture medium (supplemented with 15% of bovine fetal serum, glucose and glutamine) at 37ºC, with pH control. The results showed that the addition of dextran sulfate (at 0.5% and 1%) and of 100% of alginate microspheres (in relation to the number of Cultspher-S particles) to the culture caused considerable cell death; and the control (without additives) as well as the addition of 50% of alginate microspheres promoted cell growth. The formation of clusters was observed in cultures; however, it was delayed with the addition of 50% of alginate microspheres. This occurrence allowed a cellular expansion factor of 50.4 times (with dilution factor correction) and of 13.1 times (without correction). The recovered cells after expansion kept their immunophenotypic characteristics. / O crescente interesse na utilização de células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular é atribuído principalmente à sua plasticidade e capacidade regenerativa. As CMMs representam uma revolução no tratamento de inúmeras doenças e no entendimento dos mecanismos de reparo tecidual. Sua baixa disponibilidade nos tecidos (de 0,00001 à 0,0002%) associada à necessidade de elevadas doses para as aplicações terapêuticas (aproximadamente 2 x 106 células/kg paciente) e à ineficiência dos cultivos tradicionais (em monocamada) in vitro para atender à alta demanda existente para essas aplicações, tornaram indispensável o desenvolvimento de novas tecnologias de expansão ex vivo em larga escala. A utilização de biorreatores tipo frascos spinner com microcarregadores em suspensão é um sistema alternativo eficaz para esta expansão. O relato bibliográfico de cultivos com esse sistema, no entanto, tem indicado a formação de grandes aglomerados de microcarregadores com células como um possível obstáculo na obtenção de maior produtividade celular. Tais aglomerados dificultam a difusão de nutrientes, gases (principalmente o oxigênio) e reagentes de quantificação celular indireta em seu interior; e prejudicam a recuperação das células no final do cultivo. Microesferas de alginato tornaram-se interessantes para diminuir a frequência de colisões entre os microcarregadores, pois não se aderem às células nem aos microcarregadores podendo evitar a união dos mesmos. O sulfato de dextrana foi descrito na literatura tanto como inibidor do contato célula-célula, quanto do encontro entre microcarregadores em cultivo, por isso também passou a ser uma opção promissora para evitar a formação de aglomerados de microcarregadores. Assim, os objetivos deste trabalho foram desenvolver uma metodologia de cultivo de CMMs em frasco spinner com microcarregadores Cultispher-S para aplicação em terapia celular e avaliar a influência de microesferas de alginato e do sulfato de dextrana nesse cultivo. Para isso, a linhagem hMSC-TERT e 3 g/L Cultispher-S foram mantidos em spinner de 100 mL contendo meio de cultura α-MEM (suplementado com 15% de soro fetal bovino, glicose e glutamina), a 37ºC, com controle de pH. Os resultados mostraram que a adição de sulfato de dextrana (à 0,5% e 1%) e de 100% de microesferas de alginato (em relação ao número de partículas de Cultispher-S) ao cultivo provocaram morte celular considerável; e que o controle (sem aditivos), assim como a adição de 50% de microesferas de alginato promoveram crescimento celular. A formação de aglomerados foi observada nos cultivos, no entanto, ela foi atrasada com adição de 50% de microesferas de alginato. Esse fato permitiu a obtenção de um fator de expansão de 50,4 vezes (com a correção do fator de diluição) e de 13,1 vezes (sem a correção). As células recuperadas após a expansão mantiveram suas características imunofenotípicas.
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Desenvolvimento de metodologia para produção de soro AB humano para suplementação de meio de cultura destinado ao cultivo de células mesenquimais / Development of methodology for human AB serum production for culture medium supplementation for the cultivation of mesenchymal cellsSantos, Vanessa Tieko Marques dos 02 December 2015 (has links)
O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative
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Desenvolvimento de metodologia para produção de soro AB humano para suplementação de meio de cultura destinado ao cultivo de células mesenquimais / Development of methodology for human AB serum production for culture medium supplementation for the cultivation of mesenchymal cellsVanessa Tieko Marques dos Santos 02 December 2015 (has links)
O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative
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