Desde el inicio de un cultivo celular, las células que lo conforman atraviesan una serie de presiones de selección donde sobrevivirán aquéllas que logren adaptarse a las condiciones desde el sistema in vivo al sistema in vitro. La mayoría de los cultivos celulares de vertebrados no progresan más allá de un número finito de divisiones y entran en senescencia replicativa. En muchas ocasiones, ya sea por inducción o espontáneamente, algunos cultivos celulares pueden adquirir una serie de características proliferativas anormales (independencia de anclaje, pérdida de inhibición de contacto, disminución de la limitación de la densidad de crecimiento, entre otras) proceso denominado transformación celular el cual a menudo se puede correlacionar con la tumorigenicidad. El objetivo general del presente plan de investigación es enunciar nuevos conocimientos en el campo de la Biología Celular y Molecular vinculados con la transformación celular in vitro acontecida en cultivos celulares provenientes de células fetales de conejo (Oryctolagus cuniculus). El cultivo inicial se originó a partir de células obtenidas de piel de la especie en cuestión mediante disgregación enzimática. La línea celular originada a partir de este cultivo se denominó JPCS1. Todos los estudios presentados en esta Tesis se realizaron cada cinco SCs (subcultivos), entre el SC 5 al SC 25 y cada diez SCs desde el SC 30 al SC 50. Para evidenciar la inestabilidad genética los estudios se realizaron tanto a nivel citogenético como molecular. A nivel citogenético se analizaron los cambios en la frecuencia del número cromosómico como así también la evolución del cariotipo de la línea celular durante su mantenimiento entre el SC 5 al 50. A nivel molecular, se utilizó como marcador de inestabilidad genética un conjunto de loci de microsatélites. Las características del control de crecimiento de la línea JPCS1 fueron evaluadas mediante el análisis de las curvas de crecimiento. En las mismas se obtuvo tanto el tiempo de duplicación poblacional media como la densidad limitante de proliferación celular. Asimismo, se realizó el estudio de curvas de crecimiento con independencia de suero donde se obtuvo la pendiente de la curva de crecimiento y la capacidad de proliferación celular en ausencia de suero. Asimismo, también fue analizado el crecimiento independiente de anclaje. Por último, la capacidad de migración celular fue investigada mediante la técnica de la herida. Los resultados de nuestras investigaciones llevados a cabo para dar cumplimiento con los objetivos de la presente Tesis Doctoral demuestran que la misma presenta inestabilidad cromosómica a partir del SC 10, previo a los cambios en los parámetros de crecimiento y migración celular, evidenciando una tendencia al aumento del número cromosómico (hiperdiploidización) cambiando el número modal desde 44 a 46 cromosomas. A partir de ganancias cromosómicas, en primera instancia por una trisomía en el cromosoma 18 a partir del SC 10 y en segunda instancia por trisomía en el cromosoma 6 a partir del SC 20 y posteriormente por tetrasomía del mismo cromosoma en el SC 40. Asimismo, la línea celular muestra un incremento en la frecuencia de la deleción de 10p -del(10)(p13)- a partir del SC 30. A nivel molecular, los resultados obtenidos demuestran que la línea JPCS1 exhibe estabilidad genética del panel de microsatélites utilizados, sin encontrarse nuevos alelos para estos marcadores ni desbalance de las variantes alélicas en los loci heterocigotas. En cuanto a los parámetros de crecimiento celular evaluados, la línea celular en cuestión presenta un acortamiento del ciclo celular demostrando un cambio abrupto entre los SCs 30 y 40, determinado por la disminución del tiempo de duplicación poblacional. Asimismo, se pudo evidenciar la existencia de una tendencia al aumento progresivo de la densidad limitante de la proliferación celular a medida que se incrementa el tiempo de cultivo, exhibiendo una disminución de la inhibición por contacto. Por otra parte, en las etapas más avanzadas del mantenimiento esta línea JPCS1 se caracteriza por exhibir crecimiento con independencia de las necesidades de factores de crecimiento, ya sea por producción autócrina o por presentar algún mecanismo de señalización intracelular alterado. La línea celular JPCS1 no demostró crecimiento con independencia de anclaje en ninguno de los SCs analizados. Por último la misma exhibió un aumento de la capacidad migratoria de las células a partir del SC 25, tendencia que se acentúa en el SC 40 demostrando una disminución de la inhibición por contacto en concordancia con los ensayos de proliferación celular. A partir de los resultados obtenidos en las investigaciones llevadas a cabo durante el desarrollo del presente trabajo de Tesis Doctoral se ha puesto en evidencia, mediante los diferentes estudios realizados que la línea celular JPCS1 originada a partir de células de embriones de Oryctolagus cuniculus luego de su mantenimiento en el sistema in vitro que el cultivo celular se encuentra transformado en el SC 40 proceso que no ha terminado, y que la inestabilidad genética a nivel cromosómico es un evento inicial del proceso de transformación.

Bartonella henselae es un microorganismo Gram negativo, zoonótico, oportunista y cosmopolita, causante de diversas patologías humanas emergentes y reemergentes, que varían desde infecciones autolimitantes hasta fallas multiorgánicas y muerte dependiendo del estado inmunitario del afectado. El presente estudio analítico-descriptivo fue desarrollado en dos etapas; en la primera, se estandarizó la prueba de aislamiento de Bartonella henselae cepa ATCC 49882 por el método de Shell Vial en líneas celulares continuas Vero y Hep-2, determinándose la línea celular más susceptible a la infección en un tiempo determinado de incubación. En la segunda etapa, se realizó el aislamiento primario empleando la técnica estandarizada, evaluándose 60 muestras de sangre total de pacientes procedentes del sistema de vigilancia de enfermedades febriles metaxénicas a nivel nacional (INSCNSP) asociadas a factores epidemiológicos favorables a la infección por Bartonella henselae. Las muestras seleccionadas fueron reportadas como negativas a rickettsiosis y Enfermedad de Carrión. En ambas etapas, se determinó la presencia o ausencia del microorganismo de interés mediante la técnica de Inmunofluoresecencia Indirecta (IFI-Bartonellosis), coloración Giménez y la valoración cualitativa del efecto citopático. Los resultados obtenidos aplicando la técnica estandarizada fueron, 5 aislamientos primarios a partir de 60 muestras de sangre total (3 en células Vero y 5 en células Hep-2) en un periodo de incubación de 12 días a 37°C. De los resultados obtenidos en el desarrollo de la primera y segunda etapa se concluyó que Hep-2 es la línea celular más susceptible a la infección por Bartonella henselae. Palabras claves: Bartonella henselae, Ctenocephalides felis, cultivo celular, Shell Vial, efecto citopático. / --- Bartonella henselae is a Gram-negative, zoonotic, opportunist and Cosmopolitan microorganism, responsible of diverse emergent and reemergents human pathologies that vary from autolimitant infeccions to multiorganic failures and death, depending of the inmunitarian status of the affected individual. The present study descriptive-analytic was developed in two stages. In the first, the isolation test of Bartonella henselae strain ATCC 49882 was standardized with the Shell Vial method in continuous cell strains, Vero y Hep-2, determining the most susceptible cell line in an established incubation period. In the second stage, the primary isolation was realized applying the standardized technique, with 60 total blood samples evaluated from patients belonging to the surveillance system of metaxenic febrile diseases nationwide (INS-CNSP) associated to favourable epidemiological factors to infections with Bartonella henselae. The selected samples were reported as negative to rickettsiosis and Carrion disease. In both stages, the presence or absence of the analyzed microorganism was determined through the indirect immunofluorescence technique (IFI-Bartonellosis), Giménez coloration and the qualitative assessment of the cytopathic effect. The results obtained applying the standardized technique came, 5 primary isolations from 60 samples of total blood (3 in Vero cells and 5 in Hep-2 cells) during a period of incubation of 12 days at 37 °C. From the results obtained in the development of the firstand second stage, it was concluded that Hep-2 is the most susceptible cell line to the infection by Bartonella henselae. Key words: Bartonella henselae, Ctenocephalides felis, cell culture, Shell Vial, cytophatic effect

O gênero Ranavirus, especialmente a espécie Frog virus 3 (FV3), é considerado uma ameaça crescente às populações de anfíbios em diversas partes do mundo, desencadeando surtos que frequentemente resultam em mortalidade em massa e perdas econômicas substanciais. Neste sentido, propusemos o isolamento de uma estirpe patogênica de FV3-like, associada a surto com alta mortalidade de anfíbios adultos (Lithobates catesbeianus) em uma ranicultura do Estado de São Paulo, Brasil, bem como a caracterização molecular e fenotípica do vírus isolado. No mais, objetivamos verificar a possível indução de morte celular por apoptose por essa estirpe. O isolamento viral foi realizado a partir de fragmentos de órgãos de animais que vieram à óbito, os quais foram inoculados em células BF-2 (Lepomis macrochirus). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi conduzida com primers específicos e dirigidos para duas regiões altamente conservadas do genoma dos ranavírus: MCP e 53R. O sequenciamento parcial do gene que codifica a proteína principal do capsídeo (MCP) foi realizado, seguido de alinhamento e análise filogenética com outros ranavírus. Outras técnicas diagnósticas, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imunofluorescência indireta e Western blot foram utilizadas na caracterização e confirmação do isolamento. Dois marcadores apoptóticos foram utilizados para investigar a possível ativação da apoptose em células BF-2 infectadas e amostradas de 4 à 16 horas, incluindo a ativação de caspases efetoras e a fragmentação do DNA celular pelo ensaio de TUNEL. Obtivemos o isolamento de uma estirpe de FV3-like com efeitos citopáticos típicos para ranavírus. A PCR confirmou a presença de DNA viral nas culturas de células BF-2 infectadas, com resultados positivos para os oligonucleotídeos direcionados para MCP e 53R. A análise da sequência nucleotídica obtida para MCP revelou alta homologia (99%) com Frog virus 3, espécie-tipo do gênero Ranavirus (família Iridoviridae) e, na reconstrução filogenética, a cepa isolada mostrou ser intimamente relacionada com outros ranavírus detectados no Brasil. As micrografias eletrônicas mostraram partículas icosaédricas em células BF-2 infectadas, com nucleocapsídeo medindo cerca de 150 ηm, semelhante aos ranavírus. No ensaio de imunofluorescência indireta, células BF-2 infectadas com o isolado FV3-like, apresentaram marcação de imunofluorescência positiva para MCP, enquanto que MCP foi demonstrada por um ensaio de Western blot, onde observamos um polipeptídeo com massa molecular estimada em 50 kDa. Por fim, verificamos que o isolado FV3-like é capaz de induzir apoptose em células BF-2, uma vez que foram detectadas caspases efetoras em todos os tempos experimentais, sugerindo ser um mecanismo caspase-dependente. A fragmentação do DNA celular, claramente observada em todos os tempos experimentais, confirmou a indução de apoptose pela estirpe brasileira de FV3-like. Os resultados aqui obtidos tornam-se a base para diversos estudos futuros, podendo ainda contribuir como subsídio para a melhor compreensão dos surtos provocados por estes vírus no país. / The genus Ranavirus, especially the Frog virus 3 (FV3) species, is considered a growing threat to amphibian populations in various parts of the world, triggering outbreaks that often result in mass mortality and substantial economic losses. In this sense, it was proposed the isolation of a pathogenic FV3-like strain associated with an outbreak with high mortality of adult amphibians (Lithobates catesbeianus) in a frog farm in the State of São Paulo, Brazil, as well as the molecular and phenotypic characterization of the isolated virus. In addition, we aimed to verify the possible induction of the mechanism of cell death by apoptosis by this strain. Virus isolation was performed from organ fragments of animals that died, which were inoculated into BF-2 cells (Lepomis macrochirus). The polymerase chain reaction (PCR) technique was conducted with specific primers and directed to two highly conserved genome regions of the ranavirus: MCP and 53R. Partial sequencing of the gene encoding the major capsid protein (MCP) was performed, followed by alignment and phylogenetic analysis with other ranaviruses. Other diagnostic techniques, including transmission electron microscopy, indirect immunofluorescence and Western blot were used in the characterization and confirmation of the isolation. Two apoptotic markers were used to investigate the possible activation of apoptosis in infected BF-2 cells and sampled from 4 to 16 hours, including the activation of effector caspases and the fragmentation of cellular DNA by the TUNEL assay. We obtained the isolation of an FV3-like strain with typical cytopathic effects for ranavirus. PCR confirmed the presence of viral DNA in cultures of infected BF-2 cells, with positive results for MCP and 53R oligonucleotides. Analysis of the nucleotide sequence obtained for MCP revealed high homology (99%) with Frog virus 3, type species member of the genus Ranavirus (family Iridoviridae) and, in phylogenetic reconstruction, the isolated strain showed to be closely related to other ranaviruses detected in Brazil. Electron micrographs showed icosahedral particles in infected BF-2 cells, with a nucleocapsid measuring about 150 ηm, similar to ranaviruses. In the indirect immunofluorescence assay, BF-2 cells infected with the FV3-like isolate showed positive immunofluorescence labeling for MCP, whereas MCP was demonstrated by a Western blot assay, where we observed a polypeptide with a molecular mass estimated at 50 kDa. Finally, we verified that the FV3-like isolate is able to induce apoptosis in BF-2 cells, since effector caspases were detected at all experimental times, suggesting to be a caspase-dependent mechanism. The fragmentation of cellular DNA, clearly observed at all experimental times, confirmed the induction of apoptosis by the Brazilian FV3-like strain. The results obtained here become the basis for several future studies, and may contribute as a subsidy to better understand the outbreaks caused by these viruses in the country.

A aquicultura é apontada como um mercado estratégico para o desenvolvimento sustentável, produção de alimentos e ampliação de fronteiras inexploradas no Brasil. No entanto, como outros sistemas de produção animal, este setor enfrenta problemas com doenças resultantes de sua intensificação, como os aspectos sanitários da produção e a falta de estrutura para o diagnóstico das principais enfermidades infecciosas. Durante os últimos 20 anos, os vírus da família Iridoviridae, em especial membros do gênero Ranavirus, têm sido responsáveis por epizootias de grande impacto ecológico e econômico, envolvendo um grande número de espécies de peixes, anfíbios e répteis de importância na aquicultura de várias partes do mundo. No entanto, as informações sobre a ocorrência de infecções de peixes e anfíbios causadas por ranavírus no Brasil são limitadas. O presente projeto compreendeu o isolamento em cultivo celular de estirpe de Frog Virus 3-símile, no Estado de São Paulo, confirmada por sequenciamento nucleotídico do gene MCP e subsequente RFLP, assim como caracterização fenotípica e de cinética de replicação do isolado. Amostras de fígado, baço e rins de rãs-touro gigante provenientes de ranário comercial, positivas ao diagnóstico molecular para Ranavirus, foram utilizadas para isolamento viral em cultivo celular. Efeito citopático foi detectado na segunda passagem em células BF-2 e posterior confirmação do isolamento foi feita por PCR e RFLP. A caracterização fenotípica viral foi feita com microscopia eletrônica de transmissão, a qual permitiu a confirmação de morfologia semelhante às partículas de Ranavirus, além da realização de curva de replicação, indicando maiores títulos virais no quarto dia após inoculação. Também foi feito teste de susceptibilidade a solventes, que confirmou a presença de partículas envelopadas. Os resultados obtidos nesse estudo poderão contribuir para a futura compreensão da biologia dos iridovírus circulantes como agentes etiológicos de ranaviroses em anfíbios no Estado de São Paulo. / Aquaculture is appointed as a strategic market for sustainable development, food production and expansion of unexplored frontiers in Brazil. However, just like other animal production systems, this area faces problems due its intensification, like the production sanitation aspects and the lack of structure for the diagnosis of major infectious diseases. During the last 20 years, viruses from Iridoviridae family, especially Ranavirus genera, have been responsible for major economic and ecological impactant epizootic diseases in a great number of fish, amphibian and reptile species in many parts of the world. However, information on the occurrence of infections in fishes and amphibians caused by Ranavirus in Brazil are limited. In this context, this project aimed to isolate a Frog Virus 3-like strain detected in São Paulo state in cell culture, which was later confirmed by nucleotide sequencing of MCP gene and further RLFP technique and also phenotipical characterization and replication kinetics of the obtained strain. Liver, spleen and kidney samples from american bullfrogs from commercial frog ponds, positive by molecular diagnostic for Ranavirus, were used for viral isolation in cell culture. Citopathic effect was detected during the second passage in cells and later confirmed by PCR and RFLP. The viral characterization was carried out with transmission electronic microscopy, which confirmed similar morphology of viral particles to those of Ranavirus, besides the construction of a growth curve which indicated larger titres on the fourth day post inoculation. A test for solvent sensitivity was also performed and confirmed the presence of enveloped particles. The results obtained in this study will contribute to the understanding of the biology of the circulating iridovirus in São Paulo state as an etiological agent of Ranavirus infection in amphibians.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: Os queratinócitos são células presentes na epiderme, constituída pelo epitélio estratificado pavimentoso queratinizado. Estas células organizam-se em camadas de diferentes estágios de maturação celular (camada basal ou germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea) e tem a função de revestimento desses tecidos. Diversos estudos buscam elucidar e caracterizar tecidos hígidos de origem epitelial, como pele, olhos e casco, para que possam identificar os mecanismos de desenvolvimento de enfermidades nesses tecidos. O casco equino é formado por epiderme em diferentes estágios de queratinização, subdivididos em estrato externo ou parede do casco, estrato médio e estrato interno, nesse último estão localizadas as lâminas epidermais primárias (LEP) e secundárias (LES) onde os queratinócitos estão presentes junto a membrana basal (transição de epiderme e derme, junção que faz a adesão do casco com a falange distal). É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo, foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenient... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The keratinocytes are cells presented in the epidermis, constituted by the stratified keratinized squamous epithelium. These cells organized in layers of different stages of cell maturation (basal or germinative, prickly, granular, lucid and corneal layers) and have a tissue coating function. Several studies seek to elucidate and characterize healthy tissues of epithelial origin, such as skin, eyes and hoof, so that they can identify the mechanisms of development of diseases in these tissues. The equine hoof is composed of epidermis at different stages of keratinization, subdivided into external stratum, middle stratum and internal stratum, in which the primary epidermal lamellae (PEL) and secondary epidermal (SEL) are located and where keratinocytes are present along the basement membrane (Transition of the epidermis and dermis, which joins the hoof to the distal phalanx). It is evident the importance of the hoof health of horses, but the knowledge at the cellular level is poorly understood. Studies involving the culture of equine keratinocytes are scarce. The development of keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods are already established, such as for culture of skin keratinocytes, but few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The aim of this study was to standardize the cultivation of keratinocytes from equine hoof, aiming future associate with the study of regenerative medici... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:14:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8672_1.pdf: 5684115 bytes, checksum: 32cd11bfaad9311eee7efae7479152fb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A maioria das exposições humanas às radiações ionizantes envolve irradiação parcial do corpo humano. Com isso, o emprego da dosimetria citogenética, sem consideração desse aspecto, pode resultar na subestimação da dose absorvida pelo indivíduo. Neste contexto, essa pesquisa estudou parâmetros metodológicos da biodosimetria, tais como tempo de cultivo celular, tempo de adição de Colcemid e métodos de coloração citogenética, objetivando fornecer um planejamento de escolha metodológica que seja mais adequado ao tipo de irradiação (parcial ou de corpo inteiro). Para tanto, amostras de sangue de um doador saudável foram irradiadas com doses de 1,5; 3,0 e 4,0 Gy de raios-X. Os métodos de coloração, Giemsa, DAPI, bandeamento C e FISH, foram comparados em relação à eficácia na identificação de aberrações cromossômicas, a partir das amostras irradiadas com 1,5 e 3,0 Gy. A irradiação parcial do corpo foi simulada por meio da mistura de 70% da amostra de sangue irradiada com 4,0 Gy com 30% de sangue não irradiado. Os resultados obtidos nesta pesquisa indicaram que a comparação das freqüências de aberrações cromossômicas obtidas com tempo de cultura de 48 horas, com aquelas obtidas em culturas prolongadas de 72 horas, permite a distinção entre uma exposição parcial e de corpo inteiro, em função do atraso mitótico da população de linfócitos irradiados. Por outro lado, culturas com adição prévia de Colcemid e com duração de 72 horas, apesar de garantir que as células permaneçam em primeira divisão mitótica (M1), apresentaram cromossomos com elevada condensação. Em relação às técnicas de coloração, embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os resultados das estimativas de dose obtidas, contatou-se que o método de FISH e de bandeamento C são indicados para elucidação de imagens duvidosas

A aquicultura é apontada como um mercado estratégico para o desenvolvimento sustentável, produção de alimentos e ampliação de fronteiras inexploradas no Brasil. No entanto, como outros sistemas de produção animal, este setor enfrenta problemas com doenças resultantes de sua intensificação, como os aspectos sanitários da produção e a falta de estrutura para o diagnóstico das principais enfermidades infecciosas. Durante os últimos 20 anos, os vírus da família Iridoviridae, em especial membros do gênero Ranavirus, têm sido responsáveis por epizootias de grande impacto ecológico e econômico, envolvendo um grande número de espécies de peixes, anfíbios e répteis de importância na aquicultura de várias partes do mundo. No entanto, as informações sobre a ocorrência de infecções de peixes e anfíbios causadas por ranavírus no Brasil são limitadas. O presente projeto compreendeu o isolamento em cultivo celular de estirpe de Frog Virus 3-símile, no Estado de São Paulo, confirmada por sequenciamento nucleotídico do gene MCP e subsequente RFLP, assim como caracterização fenotípica e de cinética de replicação do isolado. Amostras de fígado, baço e rins de rãs-touro gigante provenientes de ranário comercial, positivas ao diagnóstico molecular para Ranavirus, foram utilizadas para isolamento viral em cultivo celular. Efeito citopático foi detectado na segunda passagem em células BF-2 e posterior confirmação do isolamento foi feita por PCR e RFLP. A caracterização fenotípica viral foi feita com microscopia eletrônica de transmissão, a qual permitiu a confirmação de morfologia semelhante às partículas de Ranavirus, além da realização de curva de replicação, indicando maiores títulos virais no quarto dia após inoculação. Também foi feito teste de susceptibilidade a solventes, que confirmou a presença de partículas envelopadas. Os resultados obtidos nesse estudo poderão contribuir para a futura compreensão da biologia dos iridovírus circulantes como agentes etiológicos de ranaviroses em anfíbios no Estado de São Paulo. / Aquaculture is appointed as a strategic market for sustainable development, food production and expansion of unexplored frontiers in Brazil. However, just like other animal production systems, this area faces problems due its intensification, like the production sanitation aspects and the lack of structure for the diagnosis of major infectious diseases. During the last 20 years, viruses from Iridoviridae family, especially Ranavirus genera, have been responsible for major economic and ecological impactant epizootic diseases in a great number of fish, amphibian and reptile species in many parts of the world. However, information on the occurrence of infections in fishes and amphibians caused by Ranavirus in Brazil are limited. In this context, this project aimed to isolate a Frog Virus 3-like strain detected in São Paulo state in cell culture, which was later confirmed by nucleotide sequencing of MCP gene and further RLFP technique and also phenotipical characterization and replication kinetics of the obtained strain. Liver, spleen and kidney samples from american bullfrogs from commercial frog ponds, positive by molecular diagnostic for Ranavirus, were used for viral isolation in cell culture. Citopathic effect was detected during the second passage in cells and later confirmed by PCR and RFLP. The viral characterization was carried out with transmission electronic microscopy, which confirmed similar morphology of viral particles to those of Ranavirus, besides the construction of a growth curve which indicated larger titres on the fourth day post inoculation. A test for solvent sensitivity was also performed and confirmed the presence of enveloped particles. The results obtained in this study will contribute to the understanding of the biology of the circulating iridovirus in São Paulo state as an etiological agent of Ranavirus infection in amphibians.

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: As neoplasias estão se tornando cada vez mais comuns entre os animas domésticos, seja devido a maior expectativa de vida ou pelo avanço dos métodos diagnósticos e tratamentos. As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de neoplasias entre as fêmeas caninas. A procura por novos tratamentos e/ou tratamentos específicos para os animais é cada vez mais comum frente à esse quadro. A rapamicina é um fármaco antifúngico com atividade antitumoral, que atua inibindo o complexo mTOR, já testada para o tratamento de neoplasias em diferentes órgãos em humanos, podendo ser uma alternativa no tratamento de neoplasias em cães. Devido ao grande número de repetições que os ensaios com fármacos necessitam, o cultivo celular in vitro é uma alternativa inicial para a descoberta de novos medicamentos eficazes no tratamento dessa espécie, além de também se tornar um ensaio pré-clínico. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da rapamicina em células de tumores mamários primários e suas respectivas metástases de cadelas, cultivadas in vitro. Foram utilizados dois tipos histológicos tumores de mama, provenientes do tumor primário e suas respectivas metástases. Após a colheita, as amostras foram classificadas por histopatologia como carcinoma sólido grau III e carcinoma adenoescamoso, como tumores triplo negativos não basal pela imuno-histoquímica e tanto os tumores primários como suas metástases apresentaram expressão positiva para as proteínas PTEN,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Neoplasms are becoming increasingly common among animals, whether due to longer life expectancy or new diagnostic methods and treatments. Breast neoplasms are the most common type of neoplasm among canine females. The search for new treatments and / or specific treatments for animals is increasingly common in this context. Rapamycin is an antifungal drug with antitumor activity, which acts to inhibit the mTOR comple. It was already tested for the treatment of neoplasms in different organs in humans and may be an alternative in the treatment of neoplasms in dogs. Due to the large number of replicates required by drug assays, in vitro cell culture is an early alternative for the discovery of new drugs that might be effective in treatment of this species, as well as becoming a preclinical assay. The aim of this study was to evaluate the effect of rapamycin on primary and metastatic mammary dog tumor on in vitro cultured cells. Two histological types of neoplastic cells from the primary tumor and their respective metastases were used. After collection, the samples were classified by histopathology as grade III solid carcinoma and adenosquamous carcinoma, as non-basal triple negative tumors by immunohistochemistry, and both the primary tumors and their metastases presented positive expression for PTEN, AKT, mTOR and 4EBP1 proteins in immunofluorescence. A fragment of the tumor tissue was cultured in vitro and the cells were evaluated for cell morphology and phenotype, gene express... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / The skin is the largest organ from the human body and constitutes the main protection of the organism against physical and chemical agents and it is also fundamental to avoid water loss by desiccation. Formed by three distinct stratus, yet complementary, being the two main called dermis and epidermis, containing different cell types, as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Merkel cells and Langerhans cells (LCs), being these latter fundamental in the contact hypersensitivity. Due to the importance of the healthy skin maintenance to the human´s life, there is a growing need of elaboration of skin models to the treatment of injured and diseased, as well as there is a big demand of skin models to chemical tests from the pharmaceutics and cosmetology fields. Another factor of fundamental importance to the development of alternative in vitro methods is the worldwide pressure for these tests to replace animal models. This approach meets new concepts of replacement, reduction and refinement in the use of animals in scientific studies, dictating the future of cell culture and bioengineering of skin models. Thanks to the large development of cell culture and the discovery that the cultured cells can be regrouped according to the experimental delineation, the creation of skin models to in vitro studies is made possible, as for instance, tests of cytotoxicity and phototoxicity or evaluation of the initial phase from the allergic reaction and processes of skin sensitization. In this case, it is necessary the achievement of a large amount of immature Langerhans cells. The LCs are immature dendritic cells located in the epidermis and superficial epithelium that perform a central role in the skin immunity, acting as real sentinels able to collect contact antigens. Accordingly, were tested four different protocols for extraction and cryopreservation of these cells, and further analyzed its morphological and phenotypic features. We obtained no significant results in relation to the isolation, purity and CD1a positive expression in the Protocol 2. The Protocols 1A and 3 offered high levels of CD1a positively marked cells, showing the same expression levels. However, the Protocol 3 provided a bigger number of viable cells and a high purity yield, since it only uses the epidermis to obtain the single cell suspension, which places it as a model to be followed in subsequent experiments. The methods appointed here as the most promising, can be reproduced in conventional cell culture labs, contributing to increase the reproducibility and reliability of experimental results related to the LCs. In the same way, we evaluated the use of the human skin equivalents to the accomplishment of in vitro tests of cyto and phototoxicity, which can in fact reduce the use of animal models to the identification of single substances toxicity or even complex formulations.

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.