Orientadores : Luis Bahamondes, Anibal Faundes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T20:17:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hardy_DanielGustavoFaundes_M.pdf: 1217623 bytes, checksum: e4c51c5b5e91f3268c4fcd0503d092d4 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Um dos primeiros passos da Fertilização In Vitro (FIV) é o hiperestímulo ovariano para desenvolvimento folicular. A decisão sobre a escolha de um dos diversos protocolos é difícil, porque os resultados apresentados na literatura são controversos. Considerando obrigação da Universidade avaliar os procedimentos propedêuticos e terapêuticos realizados em suas dependências, foi natural incluir uma análise do custo/benefício no programa de FIV. Para isto foi desenvolvido um estudo descritivo, retrospectivo e comparativo da efetividade e relação custo/benefício de dois protocolos de desenvolvimento folicular, utilizados no Setor de Esterilidade do Departamento de Tocoginecologia da Universidade Estadual de Campinas (DTG/UNICAMP). O primeiro (protocolo 1) utilizou citrato de clomifeno, Gonadotrofina de Mulher Menopausada (hMG) e Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) e o segundo (protocolo 2) usou análogo de Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (aGnRH), hMG e hCG. Para esta avaliação utilizaram-se como indicadores o nú-mero de folículos maiores ou iguais a 15mm, oócitos recuperados, embriões obtidos, embriôes transferidos e ciclos com transferência. Para a relação custo/benefício utilizou-se o custo dos medicamentos e três hipóteses para o valor estimado das ecografias, dosagens hormonais, coleta de oócitos, laboratório de FIV e transferência de embriões: 500, 2000 e 5000 dólares americanos (US$). O protocolo 2 foi mais eficaz na obtenção de todos os indicadores por ciclo e teve um custo médio menor para os indicadores avaliados quando considerado o valor dos procedimentos. Com a hipótese de US$ 500 para estes procedimentos, os ciclos com transferência tiveram um custo médio menor no protocolo 1. Porém, este teve uma média de embriões transferidos de 1,5 por ciclo, enquanto que no protocolo 2 a média foi de 3,9. visto que um maior número de embriões transferidos aumenta até mais de três vezes a probabilidade de gravidez, concluimos que o protocolo 2 apresentou uma relação custo/beneficio melhor que o protocolo 1. / Abstract: In vitro Fertilization (IVF) is a modern technique used for The treatment of infertile couples. Ovarian follicle hyperstimulation, which can be achieved by different protocols, is one of the steps in this technique. Which protocol to use is a difficult decision because the results published on these protocols are controversial. It is considered an obligation of the University to evaluate the different propedeutic and therapeutic procedures used in its facilities and it was natural to do so with the IVF program, including acostjeffective analysis. Adescriptive, retrospective and comparative study was developed to compare effectiveness and costjeffectiveness of two ovulation induction protocols, used in the IVF cases treated at the Infertility Clinic of the Department of Obstetrics and Gynecology of the State University of Campinas, in the period of May 1991 through April 1993. Protocol 1 used Clomiphene citrate (CC), Human Menopausal Gonadotropin (hMG) and Human Chorionic Gonadotropin (hCG) 'and protocol 2 used Gonadotropin Releasing Hormone analogue (aGnRH), hMG and hCG. For the evaluations we used as indicators follicles measuring 15mm or more, oocytes recovered, embryos obtained, embryos transferred and cycles with embryo transfere The effectiveness was evaluated by the mean frequency that these indicators presented in each protocol per cycle. The cost-effective relationship was initially evaluated using only the cost of the drugs, later adding to the initial numbers one of three hypothetical values for the additional costs, 500, 2,000 and 5,000 American dollars (US$). These costs were related to the sum of the individual cost of the ultrasound examination, hormonal dosage, oocyte retrieval, IVF laboratory and embryo transfere The study groups were similar regarding the age of the women and their partners, time of infertility, type of infertility, and statistically different in that tubal factor was more frequent in protocol 2 and male factor in protocol 1. The male factor is considered important for the fertilization rate and was similar for both protocols. Protocol 2 showed higher efficacy for alI the indicators by cycle. For the initial evaluation, using only the drugs cost, protocol 1 presented a lower mean cost for alI the indicators, but protocols 2 presented a lower mean cost for the same indicators when the additional cost was added to the evaluation. Using the hypothetical value of US$ 500 for the additional costs, cycles with embryo transfer presented a lower mean cost in protocol 1. On the other hand, the number of transferred embryos was 1.5 and 3.9 for protocol 1 and 2 respecti vely. As a greater number of embryos per transfer enhances the probability of pregnancy, we concluded that protocol 2 presented a better costjeffective rate than protocol 1. / Mestrado / Mestre em Ciências Médicas

FREITAS, Tulius Augusto Ferreira de. Efetividade da utilização de incubadoras de CO2 equipadas com filtro Hepa e filtro Hepa-Voc para cultivo de embriões em ciclos de fertilização in vitro. 2010. 55 f. Dissertação (Mestrado em Tocoginecologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-26T13:42:40Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_taffreitas.pdf: 995108 bytes, checksum: 44d11e782e1718f7977bb12a14103b0e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-26T13:46:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_taffreitas.pdf: 995108 bytes, checksum: 44d11e782e1718f7977bb12a14103b0e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-26T13:46:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_taffreitas.pdf: 995108 bytes, checksum: 44d11e782e1718f7977bb12a14103b0e (MD5) Previous issue date: 2010 / ntroduction and objectives. The air quality in sterile environment is an important aspect to cell culture. It is known the culture conditions are essential for in vitro human embryo development; however there is no standardization for incubator filters in in vitro fertilization (IVF) laboratories. Recently, the incubator air quality has been receiving attention, and effect of volatile organic compounds (VOC) has being highlighted. The aim of this study was to evaluate the laboratorial outcomes of IVF cycles with embryo culture using CO2 incubators with the HEPA filter for air particles and a high efficiency VOC filter with activated coal. Material and methods. This is an observational prospective controlled study which included 160 IVF cycles at Human Reproduction Clinic CRIAR between 2008 January and 2009 September. The cycles were matched to patient age, infertility etiology, pituitary desensitization protocol, and semen origin and quality. Thirty five cycles were compared in which the embryos were cultured in CO2 incubator with HEPA filter (HEPA group) and 35 cycles where a CO2 incubator with VOC filter was used for embryos cultures (VOC group). Results. The groups were similar for general characteristics of IVF cycles. We did not observed differences about normal fertilization and embryo cleavage rates. On the other side, the proportion of high quality embryos (grade A) was higher on VOC group (50.8%) than HEPA group (35.7%; p=0.05). Conclusions. IVF cycles using CO2 incubator with VOC filter for embryo culture results in a increased high quality embryos rate, those with high implantation potential. / Introdução e objetivos. A qualidade do ar em um ambiente estéril é um aspecto de grande importância para a cultura celular. Apesar de a condição da cultura ser um fator preponderante para o desenvolvimento de embriões in vitro, não há uma padronização dos filtros utilizados nas incubadoras dos laboratórios de fertilização in vitro (FIV). Nos últimos anos, a qualidade do ar nas incubadoras de cultura embrionária vem recebendo maior atenção, e o papel dos compostos orgânicos voláteis (VOC) é um item em destaque. O objetivo deste estudo foi avaliar os resultados laboratoriais de ciclos de FIV, utilizando incubadoras de CO2 para cultura de embriões com o filtro HEPA para partículas de ar e filtro VOC de alta eficiência com carvão ativado. Materiais e métodos. Este trabalho consiste de um estudo observacional prospectivo, incluindo 160 ciclos de FIV realizados na Clínica de Reprodução Humana CRIAR, de janeiro de 2008 a setembro de 2009. Os ciclos foram pareados de acordo com a idade da paciente, fator de infertilidade, protocolo de bloqueio hipofisário e origem e qualidade do sêmen utilizado. Trinta e cinco (35) ciclos nos quais os embriões foram cultivados em incubadora de CO2 equipada com filtro HEPA (grupo HEPA) e 35 ciclos cujos embriões foram cultivados em incubadora de CO2 equipada com filtro VOC (grupo VOC) foram comparados. Resultados. Os grupos foram semelhantes em relação aos aspectos gerais dos ciclos de FIV. Não foram observadas diferenças entre os grupos quando avaliadas as taxas de fertilização normal e clivagem embrionária. À proporção de embriões de alta qualidade (grau A), entretanto, foi maior no grupo VOC (50,8%) comparado ao grupo HEPA (35,7%; p=0,05). Conclusões. Ciclos de FIV utilizando incubadoras de CO2 equipadas com sistema de filtragem de ar do tipo VOC para cultivo embrionário resultam, em maior taxa de embriões grau A, ou seja, aqueles com maior potencial de implantação.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:05:30Z : No. of bitstreams: 1 monreal_acd_dr_botfmvz.pdf: 1335046 bytes, checksum: 3c69eade80331bf5cd53339d7c048bf3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os caprinos foram os primeiros animais a serem domesticados pelo homen. Desses animais produz-se carne, leite, seus derivados, pele e pêlos. O fotoperíodo artificial tem sido utilizado apenas na sincronização de estros em caprinos. Atualmente, os caprinos ganharam importância mundial pela produção de animais transgênicos produzidos por FIV (fertilização“in vitro”). As concentrações plasmáticas de progesterona, cortisol e melatonina, durante a superestimulação ovariana na estação reprodutiva e anestro estacional ainda não foram avaliadas, bem como a influência do fotoperíodo artificial na melhora da produção de oócitos. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram avaliar se o fotoperíodo artificial empregado em cabras (120 luxes/45 dias/20 h), melhora a produção e desenvolvimento dos oócitos caprinos no período de estação reprodutiva e anestro estacional, verificar as concentrações plasmáticas de progesterona, cortisol e melatonina durante a superestimulação ovariana e quatro dias após o processo cirúrgico para colheita dos oócitos por laparotomia. Foram utilizadas 31 cabras Alpinas, distribuídas em cinco grupos, avaliando o fotoperíodo natural e artificial, sêmen fresco e congelado e heparina (200μg/mL) na capacitação espermática. Foram obtidos 720 oócitos e sete blastocistos (cinco do G3- fotoperíodo natural e dois no G2 –fotoperíodo artificial, ambos durante o anestro estacional)... . / Goats were the first animals to be domesticated by man. From these animals meat, milk, its byproducts, skin and fur are obtained. Artificial photoperiod has been used only in the synchronization of estrus in goats. Currently, goats have gained world-wide importance for the production of transgenic animals obtained by IVF (in-vitro fertilization). Plasmatic concentrations of progesterone, cortisol and melatonin, during ovarian superstimulation in the reproductive season and seasonal anestrus, or the influence of artificial photoperiod in the improvement of the production of oocytes have not yet been evaluated. Thus, the objectives of this study were to evaluate if the artificial photoperiod used in goats (120 lux/45 days/20 h), improves the production and development of goat oocytes in the reproductive seasonal period and anestrus, to verify the plasmatic concentrations of progesterone, cortisol and melatonin during ovarian superstimulation and four days after the surgical process for removal of oocytes for laparotomy. 31 Alpine goats were used, distributed into five groups, evaluating natural photoperiod and artificial, fresh and frozen semen and heparin (200æg/mL) in sperm qualification. 720 oocytes and seven blastocysts were obtained (five from the natural G3- photoperiod and two in the G2 artificial photoperiod, both during seasonal anestrus). There was no statistical difference among the groups. The plasmatic concentrations of progesterone varied during ovarian superstimulation (p<0,05) during the whole period studied, in the season and in the anestrus season. There were statistical differences in the plasmatic concentrations of cortisol (p<0,05), in the reproductive season and in the anestrus season, however the G2 (artificial photoperiod) presented intermediate hormone concentrations of cortisol between the control group and the G3 (natural photoperiod + surgery)... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientador : Gilson Hélio Toniollo / Resumo: Os caprinos foram os primeiros animais a serem domesticados pelo homen. Desses animais produz-se carne, leite, seus derivados, pele e pêlos. O fotoperíodo artificial tem sido utilizado apenas na sincronização de estros em caprinos. Atualmente, os caprinos ganharam importância mundial pela produção de animais transgênicos produzidos por FIV (fertilização"in vitro"). As concentrações plasmáticas de progesterona, cortisol e melatonina, durante a superestimulação ovariana na estação reprodutiva e anestro estacional ainda não foram avaliadas, bem como a influência do fotoperíodo artificial na melhora da produção de oócitos. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram avaliar se o fotoperíodo artificial empregado em cabras (120 luxes/45 dias/20 h), melhora a produção e desenvolvimento dos oócitos caprinos no período de estação reprodutiva e anestro estacional, verificar as concentrações plasmáticas de progesterona, cortisol e melatonina durante a superestimulação ovariana e quatro dias após o processo cirúrgico para colheita dos oócitos por laparotomia. Foram utilizadas 31 cabras Alpinas, distribuídas em cinco grupos, avaliando o fotoperíodo natural e artificial, sêmen fresco e congelado e heparina (200μg/mL) na capacitação espermática. Foram obtidos 720 oócitos e sete blastocistos (cinco do G3- fotoperíodo natural e dois no G2 -fotoperíodo artificial, ambos durante o anestro estacional)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: Goats were the first animals to be domesticated by man. From these animals meat, milk, its byproducts, skin and fur are obtained. Artificial photoperiod has been used only in the synchronization of estrus in goats. Currently, goats have gained world-wide importance for the production of transgenic animals obtained by IVF ("in-vitro" fertilization). Plasmatic concentrations of progesterone, cortisol and melatonin, during ovarian superstimulation in the reproductive season and seasonal anestrus, or the influence of artificial photoperiod in the improvement of the production of oocytes have not yet been evaluated. Thus, the objectives of this study were to evaluate if the artificial photoperiod used in goats (120 lux/45 days/20 h), improves the production and development of goat oocytes in the reproductive seasonal period and anestrus, to verify the plasmatic concentrations of progesterone, cortisol and melatonin during ovarian superstimulation and four days after the surgical process for removal of oocytes for laparotomy. 31 Alpine goats were used, distributed into five groups, evaluating natural photoperiod and artificial, fresh and frozen semen and heparin (200æg/mL) in sperm qualification. 720 oocytes and seven blastocysts were obtained (five from the natural G3- photoperiod and two in the G2 artificial photoperiod, both during seasonal anestrus). There was no statistical difference among the groups. The plasmatic concentrations of progesterone varied during ovarian superstimulation (p<0,05) during the whole period studied, in the season and in the anestrus season. There were statistical differences in the plasmatic concentrations of cortisol (p<0,05), in the reproductive season and in the anestrus season, however the G2 (artificial photoperiod) presented intermediate hormone concentrations of cortisol between the control group and the G3 (natural photoperiod + surgery)... (Complete abstract, click electronic address below). / Doutor

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Orientador: Eunice Oba / Banca: Fernanda da Cruz Landim Alvarenga / Banca: Vilter R. Russiano Vicente / Resumo: Com o crescimento da ovinocultura brasileira e implemento de biotecnologias da reprodução visando o aumento do rebanho ovino, torna-se importante o desenvolvimento de técnicas eficientes de maturação oocitária nestes animais, visando o melhor aproveitamento do potencial reprodutivo in vitro com consequente aumento de produtividade. O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diferentes suplementos adicionados ao meio de maturação in vitro de oócitos ovinos, estabelecendo o mais adequado para posterior produção in vitro de embriões. Para isto, foram colhidos ovários de ovelhas abatidas em frigoríficos do estado de São Paulo. Os ovários foram transportados em garrafa térmica com solução salina (NACL 0,9%) à 36ºC até o laboratório da FMVZ-UNESP- Botucatu. No laboratório estes foram lavados com solução salina e aspirados para obtenção dos oócitos. Foram selecionados somente complexos cumulus oocito (CCO) que apresentassem citoplasma de aspecto homogêneo e compactação das células do cumulus. .Os CCO selecionados foram lavados duas vezes em meio TCM-199 com tampão Hepes, suplementado com 10% de SFB, 0,3 mM de piruvato de sódio e 75 μg/mL de amicacina e divididos em diferentes tratamentos de maturação (100 oócitos/grupo): Tratamento 1: TCM-199 acrescido de piruvato de sódio, LH, FSH, estrógeno e gentamicina (Meio Base) + 10% de SFB; Tratamento 2: Meio base + 10% de SFB e 100μM de cisteamina; Tratamento 3: Meio Base + 4mg/ml de BSA; Tratamento 4: Meio Base + 4mg/ml de BSA e 100μM de cisteamina. O cultivo dos oócitos para maturação in vitro foi realizado em estufa a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO2 em ar por um período de 20-22h. Ao final do período de maturação nuclear, os ovócitos foram desnudados por pipetagens sendo posteriormente corados com Hoescht 33342 e avaliandos quanto a configuração nuclear utilizando-se microscopia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, with brazilian sheep farms growth and reproduction biothcnology implementation aiming for a sheep herd increase, efficient techniques development becomes important in oocytes maturation in these animals, aiming to a better use of the in vitro reproductive potential with a consequently increase in production. The aim of this work was to compare the use of different supplements added to the in vitro maturation medium of sheep oocytes slaughted in slaughter houses in São Paulo state. The ovaries were to the FMVZ-UNESP- Botucatu laboratory. In the laboratory, they were washed with saline solution and aspirated for the oocytes recovery. Only complex cumulus oocytes (CCO) that showed homogeneous cytoplasm and cumulus cells compacted were selected. The selected CCO were washed in TCM-199 medium with Hepes tampon, supplemented with 10% of SFB, 0.3 mM of Sodium Pyruvate and 75 μg/mL of amycacin and divided in differenr maturation treatments (20 oocytes/ group): treatment 1: TCM-199 plus Sodium Pyruvate, LH, FSH, estrogen and gentamycin (base medium) + 10% of SFB; Treatment 2: Base medium + 4mg/ml of BSA and 100μM of cisteamine; Treatment 3: Base médium + 4mg/ml of BSA; Treatment 4: Base medium + 4mg/ml of BSA and 100μM of cisteamine. The oocyte cultive for in vitro maturation was done in stove at a 38.5°C atmosphere with 5% of CO2 in air for a 20-22h period. By the end of the nuclear maturation period, the oocytes were taken off the maturation medium and the granulosa cells were extracted and then they were stained with Hoescht 33342 and evaluated by nuclear configuration using the epifluorescence microscopy (Leica DMIRB) with ultra-violet light. The oocytes were classified by meiotic stage in: GV (germinative vesicle), GVB (germinative vesicle break), MI (metaphase I); MII (metaphase II); and DEG (degenerated). For statistical analysis of the evaluated characteristics... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-01-23Bitstream added on 2014-06-13T19:59:07Z : No. of bitstreams: 1 pavao_gd_me_botfmvz.pdf: 255517 bytes, checksum: 04964e6a61b0b2812161672e7a887153 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com o crescimento da ovinocultura brasileira e implemento de biotecnologias da reprodução visando o aumento do rebanho ovino, torna-se importante o desenvolvimento de técnicas eficientes de maturação oocitária nestes animais, visando o melhor aproveitamento do potencial reprodutivo in vitro com consequente aumento de produtividade. O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diferentes suplementos adicionados ao meio de maturação in vitro de oócitos ovinos, estabelecendo o mais adequado para posterior produção in vitro de embriões. Para isto, foram colhidos ovários de ovelhas abatidas em frigoríficos do estado de São Paulo. Os ovários foram transportados em garrafa térmica com solução salina (NACL 0,9%) à 36ºC até o laboratório da FMVZ-UNESP- Botucatu. No laboratório estes foram lavados com solução salina e aspirados para obtenção dos oócitos. Foram selecionados somente complexos cumulus oocito (CCO) que apresentassem citoplasma de aspecto homogêneo e compactação das células do cumulus. .Os CCO selecionados foram lavados duas vezes em meio TCM-199 com tampão Hepes, suplementado com 10% de SFB, 0,3 mM de piruvato de sódio e 75 μg/mL de amicacina e divididos em diferentes tratamentos de maturação (100 oócitos/grupo): Tratamento 1: TCM-199 acrescido de piruvato de sódio, LH, FSH, estrógeno e gentamicina (Meio Base) + 10% de SFB; Tratamento 2: Meio base + 10% de SFB e 100μM de cisteamina; Tratamento 3: Meio Base + 4mg/ml de BSA; Tratamento 4: Meio Base + 4mg/ml de BSA e 100μM de cisteamina. O cultivo dos oócitos para maturação in vitro foi realizado em estufa a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO2 em ar por um período de 20-22h. Ao final do período de maturação nuclear, os ovócitos foram desnudados por pipetagens sendo posteriormente corados com Hoescht 33342 e avaliandos quanto a configuração nuclear utilizando-se microscopia... / Nowadays, with brazilian sheep farms growth and reproduction biothcnology implementation aiming for a sheep herd increase, efficient techniques development becomes important in oocytes maturation in these animals, aiming to a better use of the in vitro reproductive potential with a consequently increase in production. The aim of this work was to compare the use of different supplements added to the in vitro maturation medium of sheep oocytes slaughted in slaughter houses in São Paulo state. The ovaries were to the FMVZ-UNESP- Botucatu laboratory. In the laboratory, they were washed with saline solution and aspirated for the oocytes recovery. Only complex cumulus oocytes (CCO) that showed homogeneous cytoplasm and cumulus cells compacted were selected. The selected CCO were washed in TCM-199 medium with Hepes tampon, supplemented with 10% of SFB, 0.3 mM of Sodium Pyruvate and 75 μg/mL of amycacin and divided in differenr maturation treatments (20 oocytes/ group): treatment 1: TCM-199 plus Sodium Pyruvate, LH, FSH, estrogen and gentamycin (base medium) + 10% of SFB; Treatment 2: Base medium + 4mg/ml of BSA and 100μM of cisteamine; Treatment 3: Base médium + 4mg/ml of BSA; Treatment 4: Base medium + 4mg/ml of BSA and 100μM of cisteamine. The oocyte cultive for in vitro maturation was done in stove at a 38.5°C atmosphere with 5% of CO2 in air for a 20-22h period. By the end of the nuclear maturation period, the oocytes were taken off the maturation medium and the granulosa cells were extracted and then they were stained with Hoescht 33342 and evaluated by nuclear configuration using the epifluorescence microscopy (Leica DMIRB) with ultra-violet light. The oocytes were classified by meiotic stage in: GV (germinative vesicle), GVB (germinative vesicle break), MI (metaphase I); MII (metaphase II); and DEG (degenerated). For statistical analysis of the evaluated characteristics... (Complete abstract click electronic access below)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-08T16:45:34Z No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-11T14:43:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-11T14:43:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IngridOliveiraSilva.pdf: 4680892 bytes, checksum: f09e5202a34b51b6905050f6fd9cfc2f (MD5) / O objetivo foi avaliar o efeito de sistemas de cultura definidos na maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos utilizando um procedimento em duas etapas: inibição e a subsequente retomada do bloqueio meiótico. Na primeira etapa os CCOs foram cultivados em meio controle, MIV-B ou MIV-C por 24h. Na segunda etapa, o cultivo continuou até 32, 40 ou 48 horas para os CCOs cultivados em MIV-B ou MIV-C para avaliação tempo-dependente do estágio da meiose dos oócitos. O meio controle utilizado foi TCM-199 suplementado com SFB e FSH. Já MIV-C foi constituído por meio Alpha –MEM suplementado com PVA, insulina, IGF-I, androstenediona, aminoácidos não essenciais, trasnferrina e selênio, e a constituição de MIV-B foi semelhante à de MIV-C, porém sem a adição dos hormônios e fator de crescimento. A maturação citoplasmática foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (MET) nos tempos de 0, 24 e 48h de cultivo e também pela expressão dos genes HSP70.1, PRDX1, GDF9 e IFF1R. Os resultados mostraram que tanto MIV-C quanto MIV-B inibiram a meiose em cerca de 70% dos CCOs cultivados por 24h. Nas 24h de cultivo subsequentes, apenas 30% dos CCOs cultivados em MIV-C alcançaram o estágio maduro (MII). Já MIV-B apresentou cerca de 50% dos CCOs em MII após 32h de cultivo. Ao microscópio eletrônico o grupo controle apresentou características de maturação tais como a presença de espaço perivitelínico (PvS) desenvolvido, microvilosidades (Mv) eretas, grânulos corticais (GC) alinhados à membrana plasmática e mitocôndrias despersas pelo citoplasma. O grupo 0h apresentou características de imaturidade como pequeno PvS, Mv deitadas, GC em grumos e mitocôndrias no córtex do oócito. Os sistemas de cultura definidos proporcionaram, no entanto a presença de características intermediárias entre o grupo 0h e o grupo controle, como as Mv eretas em 83,3% dos CCOs, presença de mitocôndrias ligeiramente dispersas pelo citoplasma e GC se alinhando à membrana plasmática em 50% dos CCOs cultivados em MIV-C, apesar do bloqueio da meiose. Após 24h de cultivo em MIV-B foram observadas algumas características de maturação semelhantes ao controle maduro, como o alinhamento dos GC e a dispersão das mitocôndrias (p<0,05). As Mv ficaram num estágio intermediário e o PvS seguiu o padrão imaturo (p<0,05). Com 48h de cultivo nenhum outro avanço foi observado para os CCOs cultivados em MIV-B. O cultivo por 48h com MIV-C, no entanto promoveu a dispersão das mitocôndrias e o alinhamento dos GC como no controle maduro (p<0,05). Para a quantificação da expressão gênica por real-time-PCR, os oócitos cultivados nos meios descritos acima foram separados após 24 ou 48h de cultivo em oócitos com (CP) e sem corpúsculo polar (SCP), ou maduros e imaturos respectivamente. Oócitos frescos (0h) foram usados como controle imaturo. O resultado da quantificação da expressão dos genes em geral mostrou que tanto o cultivo com MIV-C, quanto o cultivo com MIV-B apresentou os oócitos imaturos com maior abundância relativa que os oócitos maduros, sendo que a quantificação dos oócitos maduros foi igual ao controle maduro (TCM-199) e a quantificação dos oócitos imaturos foi semelhante ao controle imaturo (0h). As exceções a essa regra foram: O grupo C48SCP (oócitos sem CP cultivados por 48h em MIV-C) para o gene PRDX1, apresentou-se semelhante ao controle maduro (p<0,05); o grupo B24CP (oócitos com CP cultivados por 24h em MIV-B) apresentou maior abundância relativa que o controle maduro para os genes PRDX1 e HSP70.1. Com relação ao gene GDF9, o cultivo dos CCOs por 24h tanto em MIV-B, quanto em MIV-C promoveu maior abundância relativa nos grupos maduros cultivados por 24h (B24CP e C24CP), quando comparados ao controle maduro (p<0,05). A abundância relativa do gene IGFIR não apresentou diferença significativa após o cultivo em MIV-C. No entanto, na comparação da quantificação desse gene após o cultivo em MIV-B por 24h foi observado que o controle maduro apresentou menor abundância relativa do que os demais grupos (p<0,05). No presente estudo, concluiu-se que o cultivo de CCOs em MIV-B ou MIV-C, por se tratar de dois meios estritamente definidos e que, portanto permitem a obtenção de respostas consistentes, constituem bons modelos para o estudo dos eventos que ocorrem durante a maturação oocitária sem necessidade do uso de inibidores da meiose. A manutenção dos CCOs em estágio imaturo in vitro sem qualquer efeito prejudicial pode ser usada para fornecer tempo adicional para estudar o processo de sincronização entre a maturação citoplasmática e nuclear durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective was to evaluate the effect of defined culture systems on nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes using a two-step procedure: inhibition and the subsequent resumption of meiotic arrest. In the first step the CCOs were cultured in control medium, MIV-B or MIV-C for 24h. In the second step, the culture continued until 32, 40 or 48 hours for the CCOs cultivated in MIV-B or MIV-C for the time-dependent evaluation of oocytes meiosis stage. The control medium used was TCM-199 supplemented with FCS and FSH. The MIV-C constitution was MEM-Alpha Medium supplemented with PVA, insulin, IGF-I, androstenedione, non-essential amino acids, transferrin and selenium, and the MIV-B constitution was similar to MIV-C, but without the addition of hormones and growth factor. The cytoplasmic maturation was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) at 0, 24 and 48 h of cultivation, and by gene expression (HSP70.1, PRDX1, GDF9 and IFF1R). The results showed that MIV-C and MIV-B inhibited the meiosis in about 70% of the CCOs cultivated by 24h. In the subsequent 24h of culture, only 30% of MIV-C CCOs reached the mature stage (MII). MIV-B already has filed about 50% of the CCOs in MII after 32 h of culture. The control group presented ultaestructural characteristics of maturation such as the presence of conspicuous perivitelline space (PvS), erect microvilli (Mv), aligned cortical granules (CG) and spread mitochondria through the cytoplasm. The 0h group has shown characteristics of immaturity as small PvS, bent Mv, clusters of CG and cortical mitochondria. Defined culture systems provided, however the presence of intermediate characteristics between the 0h group and the control group, as the erect Mv in 83.3% of CCOs, the presence of mitochondria cortical/evenly distributed by cytoplasm and aligned/cluster GC in 50% of CCOs cultivated in MIV-C, despite the meiosis arrest. After MIV-B culture for 24h were observed some maturation characteristics similar to control group, as the alignment of the CG and the spread mitochondria (p < 0.05). The Mv were in an intermediate stage and the PvS followed the immature pattern (p < 0.05). With 48h of culture no other advance was observed for the CCOs cultivated in MIV-B. The culture for 48 h with MIV-C, however promoted the dispersion of mitochondria and the alignment of the GC as in mature control (p < 0.05). For the quantification of gene expression by real-time-PCR, the oocytes cultured in the media described above were separated after 24 or 48h of culture in oocytes with (PB) and without polar body (WPB), or mature and immature respectively. Fresh oocytes were used as immature control. The result of the quantification of gene expression in general showed that MIV-C and MIV-B culture presented the immature oocytes with greatest relative abundance that the mature oocytes, and the quantification of mature oocytes was equal to the mature control (TCM-199) and the quantification of immature oocytes was similar to the immature control. The exceptions to this rule were: the C48WPB Group (oocytes without PB cultured for 48 hours MIV-C) for PRDX1 gene appeared similar to mature control (p < 0.05); the B24PB Group (oocytes with PB cultivated in MIV-B for 24h) showed higher relative abundance for PRDX1 and HSP 70.1.genes than the mature control. With respect to GDF9, 24h of culture in MIV-B or MIV-C promoted greater relative abundance in mature groups (B24PB and C24PB), than the mature control (p < 0.05). The relative abundance of IGFIR gene showed no significant difference after cultivation in MIV-C. However, the quantification of this gene after 24h of culture in MIV-B showed lower relative abundance in mature control group than the other groups (p < 0.05). In the present study, it was concluded that MIV-B and MIV-C, can be used in lieu of meiosis inhibitors and furthermore, can provide extra time to study nuclear and cytoplasmic maturation synchrony of IVM.