Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / ABSTRACT - CHAPTER I
Actomyosin from rat testis was obtained by freezing the soluble fraction and
myosin II was isolated from this actomyosin. Testis was homogenized in a buffer
extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C for 48
hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45 and the
precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 9.0, respectively). The
resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205, p43 and one that
migrated together with the front of the gel. These polypeptides were solubilized in
pH 10.8 buffer at 27°C. When isolated in a Sephacryl S-400 column, p205 cosedimented
with F-actin in the absence, but not in the presence, of ATP and was
marked with anti-myosin II. Although the testis preparation expressed low
K/EDTA-ATPase activity, a similar preparation obtained from skeletal muscle
exhibited high K/EDTA-ATPase activity. In this study, myosin II was isolated from
an actomyosin preparation obtained by freezing the soluble fraction of testis.
ABSTRACT - CHAPTER II
Actomyosin from swine, bovine and chicks brain was obtained by freezing the
soluble fraction and myosin II and V was precipitate together, and myosin II from
swine brain was partially isolated from this actomyosin. Brain was homogenized
in a buffer extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C
for 48 hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45
and the precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 10.0,
respectively). The resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205,
p53, p43 and own high Mg2+-ATPase activity. These polypeptides were
solubilized in pH 10.2 buffer at 27°C, with addition of ATP, Mg and NaCl. The
p205 from swine brain was partially isolated in a Sephacryl S-500 column. This
polypeptide of 205 kDa was marked with antibody anti-myosin II and V. Although
the brain preparation expressed low K/EDTA-ATPase activity, we observed Co2+-
ATPase activity and a stimulation of the Mg2+-ATPase activity by Tween 20. In
this study, showed a precipitation together of myosin II and V, and partially
isolated this myosin from swine brain from actomyosin preparation obtained by
freezing the soluble fraction of brain. / RESUMO GERAL -
Miosinas são proteínas motoras que translocam sobre filamentos de
actina e atualmente constituem uma superfamília com 20 classes. Algumas são
conhecidas apenas a estrutura primária através de seqüência gênica, outras já
estão bem caracterizadas bioquimicamente, como as miosinas I, II e V. São
amplamente distribuídas em todas as células eucarióticas. Apresentam como
características bioquímicas: alta atividade ATPase na presença de EDTA e alta
concentração de potássio (atividade K/EDTA-ATPase) e uma baixa atividade
Mg2+-ATPase, que é estimulada por F-actina. Preparação de actomiosina é
obtida a partir da precipitação de fração solúvel de cérebro tanto em baixa
quanto em alta força iônica e esse processo de precipitação constitui um passo
importante para purificar e caracterizar miosina II e V a partir de fração solúvel
de cérebro. Miosina II é precipitada quando a fração solúvel de cérebro é
dializada contra tampão de baixa força iônica, enquanto que, miosina V é
precipitada seletivamente em relação à miossina II, quando a fração solúvel de
cérebro é tratada com alta força iônica, sendo postulado que essa precipitação
de miosina (II e V) seja resultado de sua interação com actina e vesículas.
Recentemente temos obtido a precipitação de actomiosina a partir do
congelamento de fração solúvel de cérebro ou testículo de rato. Neste trabalho
mostramos a purificação de miosina II de testículo de rato e a obtenção de
actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho através do congelamento
de fração solúvel de cérebro e testículo.
RESUMO - CAPÍTULO I
Actomiosina de testículo de rato foi obtida através do congelamento de fração
solúvel e miosina II foi isolada a partir dessa actomiosina. Testículos foram
homogeneizados em tampão de extração, centrifugado e o sobrenadante
40.000g x 40 foi congelado a -20oC por 48 horas. O sobrenadante foi
descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45 e o precipitado foi lavado
duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 9,0, respectivamente). O precipitado
resultante é enriquecido em três polipeptídeos: p205, p43 e um que migra junto
com a frente do gel. Esses polipeptídeos foram solubilizados em tampão pH 10,8
a 27oC. O p205, isolado em Sephacryl S-400, co-sedimenta com F-actina na
ausência, mas não na presença, de ATP e foi marcado com anti-miosina II.
Embora a preparação de testículo, praticamente, não expressou atividade
K/EDTA-ATPásica, uma preparação similar obtida a partir de músculo
esquelético apresentou alta atividade K/EDTA-ATPásica. Nesse trabalho,
miosina II foi isolada a partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo
congelamento de fração solúvel de testículo.
RESUMO - CAPÍTULO II
Actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho foi obtida através do
congelamento de fração solúvel e miosina II e V foram precipitadas
conjuntamente, sendo que miosina de cérebro de suino foi parcialmente isolada
a partir dessa actomiosina. Os cérebros foram homogeneizados em tampão de
extração, centrifugado e o sobrenadante 40.000g x 40 foi congelado a -20oC por
48 horas. O sobrenadante foi descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45
e o precipitado foi lavado duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 10,
respectivamente). O precipitado resultante é enriquecido em três polipeptídeos:
p205, p53, p43 e possui alta atividade Mg2+-ATPase. Esses polipeptídeos foram
solubilizados em tampão pH 10,2 a 27oC, com adição de ATP, Mg e NaCl. O
p205 de cérebro de suino foi parcialmente isolado em Sephacryl S-500. Esse
polipeptídeo de 205 kDa foi marcado com anticorpos anti-miosina II e V. Embora
a preparação de cérebro, praticamente, não expressou atividade K/EDTAATPásica,
apresentou atividade Co2+-ATPase e uma estimulação da atividade
Mg2+-ATPase por Tween 20. Nesse trabalho mostramos a precipitação conjunta
de miosina II e V e o isolamento parcial dessas miosinas de cérebro de suino a
partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo congelamento de fração
solúvel de cérebro. / Mestre em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15852 |
| Date | 28 February 2006 |
| Creators | Dias, Decivaldo dos Santos |
| Contributors | Coelho, Milton Vieira, Hamaguchi, Amélia, Silva, Maria de Fatima Rodrigues da |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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