Σκοπός: Σήμερα η θυμεκτομή αποτελεί ευρέως αποδεκτή θεραπευτική μέθοδο για τη βαρεία μυασθένεια (ΒΜ). Επιπλέον η απόπτωση πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ΒΜ. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των δεικτών bcl-2, bcl-x, bax, Fas, Fasl (αποπτωτικές ογκοπρωτεϊνες), PCNA και Ki67 (δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού) και p53 (ογκοκατασταλτικό γονίδιο) σε παρασκευάσματα θυμεκτομών από ασθενείς με ΒΜ, και η συσχέτιση αυτής της έκφρασης με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την κλινική κατάσταση των ασθενών μετά τη θυμεκτομή. Ασθενείς και Μέθοδοι: Η μελέτη περιέλαβε 46 ασθενείς (17 άνδρες και 29 γυναίκες με μέση ηλικία 36.60±16.09 έτη) με ΒΜ, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε τροποποιημένη ριζική θυμεκτομή. Η κλινική σταδιοποίηση (ταξινόμηση κατά Osserman) πριν τη θυμεκτομή έδειξε ότι 5 ασθενείς ήταν σταδίου Ι, 21 ΙΙΑ, 17 ΙΙΒ και 3 σταδίου ΙΙΙ. Η ιστοπαθολογική εξέταση του θύμου έδειξε την παρουσία υπερπλασίας σε 26 περιπτώσεις, ατροφίας σε 8, θυμώματος σε 9 και θυμικού καρκινώματος σε 3 περιπτώσεις. Σε τομές παραφίνης, εφαρμόσθηκαν α) η ανοσοϊστοχημική μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης περοξειδάσης για τα αντισώματα εναντίον των bcl-2, bax, bcl-x, Fas, Fasl, PCNA, Ki67 και p53, β) η μέθοδος in situ υβριδισμού με ιχνηθέτες σημασμένους με διγοξιγενίνη για τους δείκτες bcl-2, bax, bcl-x, Fas και Fasl και γ) η μέθοδος in situ υβριδισμού TUNEL για την εκτίμηση του αποπτωτικού δείκτη (ΔΑΣ). Τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν μετά από μορφομετρική ανάλυση και συσχετίσθηκαν με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η αναλογία bax/bcl-2 (στα επίπεδα mRNA και πρωτεϊνης) καθορίσθηκε για κάθε δείγμα, διαιρώντας τα %bax (+) κύτταρα με τα % bcl-2 (+) κύτταρα. Η κλινική κατάσταση των ασθενών αξιολογήθηκε σε χρονικό διάστημα 39-166 (διάμεσος 86) μηνών μετά τη θυμεκτομή. Κατά τη στιγμή της αξιολόγησης και σύμφωνα με διεθνή κριτήρια (Jaretzki A, et al, Neurology 55:16, 2000) οι ασθενείς διαχωρίστηκαν ως εξής: ομάδα Α: πλήρης σταθερή ύφεση, ομάδα B: φαρμακολογική ύφεση+ελάχιστες εκδλώσεις+βελτίωση+επιδείνωση. Αποτελέσματα: Η αξιολόγηση της κλινικής κατάστασης ήταν δυνατή σε 39/46 ασθενείς. Σύμφωνα με τα προαναφερθέντα κριτήρια 13/39 ασθενείς ανήκαν στην ομάδα Α και 26/39 στην ομάδα B. Η ανάλυση απλής μεταβλητής απεκάλυψε ότι οι κλινικοί παράγοντες που σχετίζονται με πιο συχνή εμφάνιση πλήρους σταθερής ύφεσης είναι: η νεαρότερη ηλικία των ασθενών κατά τη θυμεκτομή, ο μικρότερος χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της έναρξης των συμπτωμάτων της νόσου και της θυμεκτομής (μικρότερος του έτους) και το ηπιότερο στάδιο της νόσου (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ). Όμως η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι μόνο ο μικρότερος χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της έναρξης των συμπτωμάτων της νόσου και της θυμεκτομής (μικρότερος του έτους) και το ηπιότερο στάδιο της νόσου (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες (95% CI:0.043-6.50, p=0.01 και 95% CI:1.023-4.529, p=0.043, αντιστοίχως). Η έκφραση του bcl-2 ήταν υψηλότερη στις περιπτώσεις υπερπλασίας και θυμώματος σε σχέση με τα θυμικά καρκινώματα (p<0.001). Υψηλότερη έκφραση στα καρκινώματα σε σύγκριση με τα θυμώματα και τις περιπτώσεις υπερπλασίας κατεγράφη για τους δείκτες bax (p<0.001), PCNA, Ki67 (p<0.001), Fas, Fasl, p53 και ΔΑΣ (p<0.001). Επιπροσθέτως, αυτοί οι δείκτες εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση προς τα βαρύτερα στάδια της νόσου. Η έκφραση του bcl-x δεν έδειξε καμία συσχέτιση με τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του θύμου ή τα χαρακτηριστικά της ΒΜ. Η αναλογία bax/bcl-2 (στο επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης) ήταν αυξημένη προς τα βαρύτερα στάδια της νόσου (+370% για το mRNA και +391% για την πρωτεΐνη, από το στάδιο I προς το στάδιο III). Όλες οι 13 περιπτώσεις της ομάδας Α είχαν αναλογία bax/bcl-2 <1, ενώ όλες οι 26 περιπτώσεις της ομάδας Β είχαν αναλογία >1. Η στατιστική ανάλυση απεκάλυψε: A) θετική συσχέτιση των bax(+) κυττάρων με το στάδιο της ΒΜ (p<0.001), του ΔΑΣ και των %Ki67(+) κυττάρων με το στάδιο της ΒΜ (p<0.001, αντίστοιχα), %Ki67(+) και %bax(+) κυττάρων με τον ΔΑΣ(p<0.05), %p53(+) και %bax(+) κυττάρων (p<0.05), και B) ανάστροφη συσχέτιση μεταξύ των %bcl-2(+) κυττάρων και του σταδίου της ΒΜ (p<0.05). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan Meier έδειξαν υψηλότερο διάστημα ελεύθερο νόσου, στην ομάδα A (p<0.01). Η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι η τιμή της αναλογίας bax/bcl-2 αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα (95% CI:1.078-44.073, p=0.041). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι α) ασθενείς με βαρεία μυασθένεια που υπέστησαν τροποποιημένη μεγίστη θυμεκτομή εμφάνισαν σε υψηλό ποσοστό (95%) βελτίωση των συμπτωμάτων της νόσου μετά την επέμβαση, και β) η κλινική έκβαση των μυασθενικών ασθενών μετά την μεγίστη τροποποιημένη θυμεκτομή εξαρτάται από κλινικούς και μοριακούς παράγοντες. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση των διαφόρων μοριακών δεικτών (bcl-2, bax, bcl-x, PCNA, Ki67, p53) και του αποπτωτικού δείκτη συσχετίσθηκε θετικά ή αρνητικά με τα μικροσκοπικά ευρήματα του θύμου. Αυξημένος βαθμός απόπτωσης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού συνοδεύει τα βαρύτερα στάδια της νόσου. Η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την κλινική κατάσταση των ασθενών μετά τη θυμεκτομή, είναι το μικρότερο χρονικό διάστημα μεταξύ έναρξης της νόσου και θυμεκτομής, το ηπιότερο στάδιο και η τιμή της αναλογίας bax/bcl-2 <1. Επιπλέον έρευνα χρειάζεται, η οποία θα έχει ως στόχο να καταδείξει εκείνους τους συγκεκριμένους δείκτες οι οποίοι θα παρέχουν με ασφάλεια πληροφορίες για τα μακρόχρονα αποτελέσματα της χειρουργικής θεραπείας στη μυασθένεια. / Objective: Today thymectomy is a widely accepted therapeutic option for myasthenia gravis (MG). On the other hand apoptosis seems to play a significant role in progress of MG. The aim of this study was to evaluate bcl-2, bcl-x, bax, Fas, Fasl (apoptotic oncoproteins), PCNA and Ki67 (cell proliferation markers) and p53 (tumor suppressor gene) expression in thymus from patients with myasthenia gravis (MG) and to determine the potential correlation with clinicopathologic parameters and the clinical response after thymectomy. Patients and Methods: The study included 46 patients (17 males, 29 females; mean age 36.60±16.09 years) with MG who underwent modified maximal thymectomy. Clinical staging (Osserman classification) included stage I in five, IIA in 21, IIB in 17 and III in three. Microscopic examination of thymus showed thymic hyperplasia in 26, atrophy in eight, thymoma in nine and thymic carcinoma in three cases. On paraffin sections, the streptavidin–biotin technique, using antibodies to bcl-2, bax, bcl-x, Fas, Fasl, PCNA, Ki67 and p53, was employed, and in situ hybridization with digoxigenin-labeled probes to bcl-2, bax, bcl-x, Fas and Fasl was performed. In addition, the apoptotic body index (ABI) was assessed via the TUNEL method. Staining results were expressed following morphometric analysis and were correlated with clinicopathologic parameters. Bax to bcl-2 mRNA and protein ratio was determined for each sample by dividing %bax (+) cells by % bcl-2 (+) cells. Patients were followed up for 39-166 (median 86) months. At the end of the follow-up period, according to standard criteria (Jaretzki A, et al, Neurology 55:16, 2000) patients were classified as follows: group A: complete stable remission, group B: pharmacological remission+minimal manifestations+ improvement, deterioration. Results: Follow-up data were available on 39/46 patients. According to the aforementioned criteria 13/39 patients belonged to group A and 26/39 to group B. ANOVA test revealed that the clinical factors correlated with more frequent development of complete stable remission were: the younger age of the patients, the shorter interval time between disease onset and thymectomy (less than a year) and the earlier stage (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) of the disease. However Cox regression analysis revealed that only the shorter interval time between disease onset and thymectomy (less than a year) and the earlier stage (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) of the disease constitute independent prognostic factors (95% CI:0.043-6.50, p=0.01 and 95% CI:1.023-4.529, p=0.043, respectively). Bcl-2 expression was higher in hyperplasia and thymoma cases, compared to thymic carcinomas (p<0.001). Higher expression in carcinomas, compared to hyperplasia and thymomas, was observed for bax (p<0.001), PCNA, Ki67 (p<0.001), Fas, Fasl, p53 and ABI (p<0.001). In addition these markers exhibited higher expression towards advanced stages of the disease. Bcl-x expression did not show any correlation with thymus pathology or MG features. The bax/bcl-2 mRNA and protein ratios were increased towards advanced disease stages (+370% for mRNA and +391% for protein, from MG stage I to stage III). All the 13 cases of group A had a bax/bcl-2 ratio<1, whereas all the 26 cases of group B had a ratio>1.Statistical analysis demonstrated: A) positive correlation of bax(+) cells with MG stage (p<0.001), ABI and %Ki67(+) cells with MG stage (p<0.001, respectively), %Ki67(+) and %bax(+) cells with ABI (p<0.05), %p53(+) and %bax(+) cells (p<0.05), and B) reverse correlation between %bcl-2(+) cells and MG stage (p<0.05). The Kaplan Meier survival curve showed higher percentage of complete stable remission in group A (p<0.01). Cox regression analysis revealed that the bax/bcl-2 ratio constituted independent prognostic factor (95% CI:1.078-44.073, p=0.041). Conclusions: This study shows a) that patients with MG who underwent modified maximal thymectomy for treatment developed improvement in 95% of the cases and b) that the prognosis of these patients depends on clinical and molecular factors. The expression of the several molecular markers included in this study (bcl-2, bax, bcl-x, PCNA, Ki67, p53) and the apoptotic index correlates positively or reversibly with the microscopic findings of thymus. Increased apoptosis and proliferation accompany advanced disease stage. Cox regression revealed that independent prognostic factors for therapeutic response after thymectomy are the shorter time interval between disease onset and thymectomy, the earlier stage and the bax/bcl-2 ratio<1. More extensive studies are needed in order to use these markers in the design and selection of the proper therapeutic modality in such cases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/833 |
| Date | 06 August 2008 |
| Creators | Σαλάκου, Σταυρούλα |
| Contributors | Μπονίκος, Διονύσιος, Μπονίκος, Διονύσιος, Δουγένης, Δημήτριος, Γαρταγάνης, Σωτήριος, Πέτσας, Θεόδωρος, Καρδαμάκης, Δημήτριος, Αποστολάκης, Ευστράτιος, Ζολώτα, Βασιλική |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.004 seconds