El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico activado
por ligandos, presente en el sistema nervioso central y en la unión
neuromuscular. Su estabilidad en la membrana celular es de suma
importancia, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica, que puede ser
alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. En esta Tesis
utilizamos como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea
celular que expresa de forma estable al AChR muscular adulto.
En el primer capítulo nos centramos en el estudio de la posible acción
de los diacilgliceroles (DAG) sobre la expresión/distribución del AChR.
Realizamos los experimentos con el dioctanoilglicerol (DOG), y definimos dos
tiempos de tratamiento, a los que denominamos tiempos cortos (3-4 hs) y
largos (18 hs) de incubación. A tiempos cortos, el DOG aumenta los niveles de
AChR presentes en la superficie celular, mientras que a tiempos largos los
disminuye con el concomitante aumento de los AChR intracelulares. A su vez,
el incremento de los DAG endógenos como consecuencia de la alteración de
diversas vías metabólicas, afecta de igual manera al AChR a tiempos cortos.
Como el tratamiento con un éster de forbol, molécula análoga al DAG
por su capacidad de interaccionar con los dominios C1 de diversas proteínas,
resultó en los mismos cambios sobre la distribución del AChR, concluimos que
los efectos del DOG eran debidos a su papel como segundo mensajero lipídico.
Mediante el empleo de inhibidores enzimáticos y de anticuerpos específicos
para las proteínas quinasas C (PKC) clásicas, las PKC noveles y las PKD,
determinamos que los DAG a tiempos cortos de incubación favorecerían la
inhibición de las PKCc al favorecer su desfosforilación, y esto disminuiría la
internalización del AChR. Por otra parte, el estímulo con DOG a tiempos largos
de las distintas PKC estudiadas, provocaría el efecto opuesto.
El segundo capítulo se centró en el estudio de la distribución de los
clústeres de AChR, generados por la unión de anticuerpos, en dominios
lipídicos con diferentes valores de polarización generalizada (GP). Esta
medición se realizó gracias a la tinción de las células con di-4-ANEPPDHQ,
una sonda fluorescente capaz de poner en evidencia los cambios en la
polaridad de la membrana, relacionados a un orden de membrana
determinado.
La depleción del colesterol (Col) disminuye los valores promedio de la
GP de la membrana, aumentando en consecuencia la asociación de los
clústeres de AChR a dominios de membrana más desordenados. Por otra
parte, la despolimerización del citoesqueleto de actina con Latrunculina A,
produce el efecto contrario al aumentar la asociación de los acúmulos de
AChR con dominios de membrana más ordenados. Estos resultados indican
que la distribución del AChR en la superficie celular depende del contenido de
Col y de la integridad del citoesqueleto de actina.
Por otra parte, el AChR se internaliza en pequeñas vesículas con valores
bajos de la GP y bajo contenido de Col, situación que se mantiene frente a la
depleción del Col producida por el tratamiento con metil-β-ciclodextrina,
demostrando entonces que la endocitosis del AChR requiere de la disociación
previa del receptor con dominios ricos en Col presentes en la membrana. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is a ligand-gated ion
channel, present at the neuromuscular junction and central nervous
synapses. Its stability at the cell membrane is important in determining
cholinergic responses and can be altered under physiological and pathological
conditions. In this thesis, we used CHO-K1/A5 cells, a cell line that expresses
the adult muscle AChR in a stable manner.
In the first chapter, we focus on the study of the possible effects of
diacylglycerols (DAGs) on expression/distribution of AChR. We performed
experiments with dioctanoylglycerol (DOG), and define two treatment times,
which we name short (3-4 h) and long (18 h) incubation times. DOG increases
AChR levels on the cell surface at short incubation times. At long treatment
times however, surface AChRs decrease with the concomitant increase of
intracellular AChRs. Besides, endogenous DAGs increase due to the alteration
of various metabolic pathways, equally affecting AChR at short times.
Since treatment with a phorbol ester, a DAG analogous because of its
ability to interact with the C1 domain of different proteins, resulted in similar
changes on AChR distribution, we conclude that DOG effects were due to its
role as a lipid second messenger. By using specific enzyme inhibitors and
antibodies to classical and novel protein kinases C (PKC) and PKD, we
determined that DAGs inhibit PKCc by promoting its dephosphorylation at
shorter incubation times, and thus the internalization of AChR decreases.
Moreover, DOG stimulation of different PKCs at long treatment times, causes
the opposite effect.
The second chapter is focused on the study of AChR clusters
distribution, generated by antibody binding, at lipid domains with different
generalized polarization (GP) values. This measurement was performed by
staining cells with di-4-ANEPPDHQ, a fluorescent probe that senses changes
in the polarity of the membrane, related to membrane order.
Cholesterol depletion diminishes the mean cell membrane di-4-
ANEPPDHQ GP and concomitantly the number of AChR clusters associated
with more disordered membrane domains increases. Depolymerization of the
filamentous actin cytoskeleton by Latrunculin A has the opposite effect, with
more AChR clusters associated with more ordered domains. In conclusion, the
distribution of AChR submicron-sized clusters at the cell membrane depends
on cholesterol content and cytoskeleton integrity.
AChR internalizes via small vesicles having lower GP and lower
cholesterol content than cell surface. This also occurs upon cholesterol
depletion by methyl-β-cyclodextrin. Thus, AChR endocytosis is primed by
receptor dissociation from Chol-rich plasmalemma domains.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/511 |
| Date | 06 October 2014 |
| Creators | Kamerbeek, Constanza Belén |
| Contributors | Barrantes, Francisco J., Borroni, María Virginia |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 0 |
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